富含BMP-2的PLGA材料制備及對(duì)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的應(yīng)用研究.pdf

1、目的：骨和關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)迄今尚未有一種理想的方法，而對(duì)前者的研究較多，對(duì)軟骨缺損的研究相對(duì)較少。臨床治療關(guān)節(jié)軟骨缺損常用軟骨成形術(shù)、骨髓刺激術(shù)等，由于修復(fù)的軟骨成分以纖維軟骨為多、短期效果尚可、但長(zhǎng)期隨訪效果欠佳。間充質(zhì)干細(xì)胞的多方向分化潛能，一直是軟骨修復(fù)研究的熱點(diǎn)，但是對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨分化后的問(wèn)題仍存在著的爭(zhēng)論。多能干細(xì)胞也用于軟骨缺損的修復(fù)，由于涉及倫理道德問(wèn)題及長(zhǎng)期使用發(fā)生腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，也阻礙了多能干細(xì)胞的進(jìn)一步研究。支架材

2、料同樣是研究的熱點(diǎn)，特別是天然材料，如水凝膠、膠原等，但存在植入體內(nèi)后機(jī)械強(qiáng)度差，降解時(shí)間難以控制等問(wèn)題；人工合成高分子材料，如聚乳酸（PLA）和聚乙醇酸(PGA),有容易出現(xiàn)局部酸中毒、過(guò)量加熱引起單體鏈解聚等問(wèn)題；羥磷灰石等生物材料由于脆性大、塑性困難，較少用于軟骨修復(fù)中。組織工程方法特別是模仿自然軟骨形成步驟的方法目前是研究的熱點(diǎn)，但是對(duì)軟骨的構(gòu)建離臨床的應(yīng)用尚有很長(zhǎng)一段距離。正是基于目前關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)尚無(wú)“金標(biāo)準(zhǔn)”的情況下，

3、本實(shí)驗(yàn)希望能尋找到更理想的材料和方法，除了能夠通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明制備的材料對(duì)骨組織工程的應(yīng)用可行性外，最主要的是希望材料能促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)，為未來(lái)臨床的應(yīng)用夯實(shí)基礎(chǔ)，這是本論文研究的目的和出發(fā)點(diǎn)。
　　方法：
　　1.制備骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2）與磷脂復(fù)合物：BMP-2與磷脂按照不同的比例，溶解在有機(jī)化學(xué)溶劑中，經(jīng)過(guò)冷凍干燥形成復(fù)合物。
　　2.采用溶液澆鑄法制備聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（

4、BMP-2）和磷脂的復(fù)合物膜。
　　3.檢測(cè)復(fù)合物的理化特征，包括：BMP-2的包封率、復(fù)合材料的靜態(tài)接觸角、吸水率、掃描電鏡下的形態(tài)、能量色譜儀分析等等，并對(duì)材料的BMP-2體外釋放能力通過(guò)透析法進(jìn)行測(cè)定。
　　4.PLGA-BMP-2-磷脂復(fù)合物與OCT-1成骨樣細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，通過(guò)細(xì)胞粘附試驗(yàn)、細(xì)胞增殖試驗(yàn)、免疫組織化學(xué)分析、細(xì)胞堿性磷酸酶測(cè)定、實(shí)時(shí)定量熒光 PCR分析等方法了解并比較制備的復(fù)合緩釋材料對(duì)細(xì)胞粘附、增殖、

5、分化特別是長(zhǎng)期生長(zhǎng)的影響。
　　5.制備新西蘭大白兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，將制備的復(fù)合物植入軟骨模型內(nèi)，通過(guò)大體標(biāo)本、組織學(xué)染色、核磁共振掃描等方法觀察并比較植入物修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損情況。
　　結(jié)果：
　　1.PLGA-BMP-2-磷脂復(fù)合物的包封率、靜態(tài)接觸角、吸水性、掃描電鏡形態(tài)及體外釋放試驗(yàn)結(jié)果均明顯優(yōu)于試驗(yàn)對(duì)照（PLGA-BMP-2）。特別是BMP-2的體外釋放，實(shí)驗(yàn)組在長(zhǎng)達(dá)30天觀察中仍有BMP-2表達(dá)，

6、而對(duì)照組的釋放時(shí)間主要集中在開(kāi)始釋放的最初3天。
　　2. PLGA-BMP-2-磷脂復(fù)合物與細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組促進(jìn)了細(xì)胞的粘附與增殖，特別是長(zhǎng)時(shí)間（7天）觀察，實(shí)驗(yàn)組對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用更加明顯（P＜0.01）；對(duì)細(xì)胞免疫組化分析顯示實(shí)驗(yàn)組能夠提高OCT-1細(xì)胞的Ⅰ型膠原表達(dá)；實(shí)驗(yàn)組在長(zhǎng)期觀察中（15天）顯示出對(duì)細(xì)胞堿性磷酸酶活性有更強(qiáng)的影響，與對(duì)照組有顯著的差異（P＜0.01）；同樣在長(zhǎng)期觀察中（15天），通過(guò)RT-

7、PCR測(cè)定OCT-1細(xì)胞的成骨相關(guān)基因：骨鈣素(OCN)、膠原蛋白（COL）、骨橋蛋白(OPN)、RUNT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）的表達(dá)，均顯示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著性差異（P＜0.01），實(shí)驗(yàn)組明顯上調(diào)了這些基因表達(dá)。
　　3.動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨缺損的體內(nèi)修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在2周、4周、8周、12周，經(jīng)過(guò)大體標(biāo)本觀察、組織學(xué)檢查、MRI檢查均顯示出實(shí)驗(yàn)組修復(fù)軟骨缺損的能力更強(qiáng)。特別是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)期觀察（8周、12周），實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間比

8、較有顯著性差異（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.磷脂增強(qiáng)了 PLGA與BMP-2的結(jié)合能力，解決了既往PLGA/BMP-2復(fù)合物中BMP-2釋放過(guò)快的問(wèn)題，證明了PLGA-BMP-2-磷脂復(fù)合物能夠達(dá)到BMP-2緩釋的目的。
　　2. PLGA-BMP-2-磷脂復(fù)合物體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)復(fù)合物能夠促進(jìn) OCT-1細(xì)胞的粘附、增殖，分化；尤其是對(duì)成骨細(xì)胞的長(zhǎng)期增殖分化有明顯影響，證明了PLGA-BMP-2-磷脂復(fù)合物有更強(qiáng)