缺氧對(duì)LIMK1介導(dǎo)的cofilin磷酸化的影響及其在腸上皮屏障功能損害中的作用研究.pdf

1、目的：
　　腸上皮屏障功能損害及通透性增加是嚴(yán)重?zé)齻缙跇O其重要的病理生理變化，但其分子機(jī)制至今仍未完全清楚。既往的研究表明，腸上皮細(xì)胞間的緊密連接(tightjunction，TJ)通過(guò)其相關(guān)蛋白如ZO-1、Occludin、Claudin等與細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白(actin)相連形成信號(hào)互通，在維持腸上皮屏障功能完整性中發(fā)揮著重要作用。在相關(guān)信號(hào)刺激下，細(xì)胞骨架蛋白活動(dòng)引起細(xì)胞回縮，緊密連接蛋白功能失調(diào)，細(xì)胞間TJ受損，細(xì)胞間隙形

2、成，導(dǎo)致通透性增加。因此，腸上皮細(xì)胞TJ蛋白如ZO-1、Occludin、Claudin等與骨架肌動(dòng)蛋白相互作用可能在燒傷后腸上皮屏障功能損害的發(fā)生中具有重要作用。
　　絲切蛋白(cofilin)是一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，在肌動(dòng)蛋白的聚合與解聚調(diào)控中具有關(guān)鍵作用。Cofilin活化能引起肌動(dòng)蛋白解聚增加，從而調(diào)控F-肌動(dòng)蛋白(F-actin)與G-肌動(dòng)蛋白(G-actin)的動(dòng)態(tài)平衡。同時(shí)，Cofilin活性又受到上游分子LIM激酶

3、(LIMK)的調(diào)控，LIMK是一類具有絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸雙重活性的激酶，能使其底物分子cofilin的Ser3位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，從而調(diào)控cofilin活性。
　　因此，假設(shè)嚴(yán)重?zé)齻缙谑苎踝杂苫黾?、ATP減少、細(xì)胞內(nèi)Ca2+變化等諸多影響因素，有可能通過(guò)對(duì)LIMK的調(diào)控，引起腸上皮細(xì)胞cofilin活性變化，肌動(dòng)蛋白動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)，影響TJ結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腸上皮屏障功能損害及通透性增加。據(jù)此，本課題擬通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，建立腸上皮細(xì)胞單層模

4、型，研究LIMK/cofilin/F-actin通路在缺氧條件下腸上皮屏障功能損害及通透性變化中的作用，以進(jìn)一步闡明嚴(yán)重?zé)齻缙谌毖毖鯐r(shí)腸上皮屏障功能損害的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.培養(yǎng)人腸上皮細(xì)胞株Caco-2，將Caco-2細(xì)胞種植于Transwell建立腸上皮細(xì)胞單層模型。細(xì)胞分為正常對(duì)照組(缺氧0h)、缺氧1、2、6、12和24h組，細(xì)胞缺氧是在1％ O2條件下進(jìn)行。
　　2.采用生物電阻測(cè)定儀檢測(cè)跨上

5、皮細(xì)胞電阻(TER)，以反映腸上皮細(xì)胞單層的屏障功能完整性;用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的葡聚糖(FITC-dextran)示蹤法檢測(cè)腸上皮細(xì)胞單層通透性的變化。
　　3.用間接免疫熒光法分別檢測(cè)細(xì)胞TJ蛋白ZO-1、Occludin及claudin-1分布的變化，Western blot法分別檢測(cè)細(xì)胞TJ蛋白ZO-1、Occludin及claudin-1蛋白表達(dá)的變化。
　　4.采用熒光法分別檢測(cè)細(xì)胞F-actin的分布和F-ac

6、tin/G-actin含量比值的變化。
　　5.采用Western blot法分別檢測(cè)cofilin、p-cofilin、LIMK1及p-LIMK1蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：
　　1.缺氧引起腸上皮細(xì)胞單層TER明顯下降，通透性顯著增加，以缺氧6h變化最明顯。
　　2.缺氧對(duì)腸上皮細(xì)胞單層TJ蛋白Occludin及Claudin-1蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響，但引起ZO-1的蛋白表達(dá)降低，并引起ZO-1、Occludi

7、n及Claudin-1分布明顯改變。
　　3.缺氧后腸上皮細(xì)胞單層F-actin形態(tài)分布明顯改變，細(xì)胞回縮，F(xiàn)-actin/G-actin含量比值明顯降低。
　　4.缺氧后腸上皮細(xì)胞單層cofilin蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，但p-cofilin蛋白表達(dá)顯著降低，cofilin磷酸化水平明顯下降。
　　5.缺氧對(duì)腸上皮細(xì)胞單層LIMK1蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響，但引起p-LIMK1蛋白表達(dá)顯著降低，LIMK1磷酸化水平明顯下降。<