Thioredoxin-1對OGD-R誘導的星形膠質(zhì)細胞氧化應激損傷的神經(jīng)保護作用及機制研究.pdf

1、背景:氧化應激是加重腦缺血再灌注損傷的主要因素之一。近年來發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的上調(diào)對缺血再灌注損傷后神經(jīng)細胞的存活有著至關重要的作用。Thioredoxin-1(Trx1)作為一種內(nèi)源性的小分子抗氧化蛋白，在神經(jīng)系統(tǒng)中能夠抵御氧化應激損傷。然而，其保護作用及其發(fā)揮作用的機制尚不清楚。
　　目的：探討Trx1對OGD/R誘導的星形膠質(zhì)細胞氧化應激損傷的抗氧化保護作用及潛在機制。
　　方法：（1）構(gòu)建四條Trx1 RNAi慢

2、病毒載體（LV3-54, LV3-135, LV3-222, LV3-288）及一條陰性載體LV3-NC，感染傳代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和轉(zhuǎn)染效率，用 RT-PCR和Western blot檢測干擾效率，篩選出干擾效果最為顯著的病毒片段。
　　（2） Trx1基因干擾后，建立星形膠質(zhì)細胞的氧糖剝奪/復氧（ Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation, OGD）模型，

3、采用MTS/LDH方法檢測細胞活性及細胞損傷程度。RT-PCR和Western blot進一步測定Trx1以及2-Cys Peroxiredoxin(Prdxs)的基因和蛋白表達。
　?。?）體外構(gòu)建 TRE序列突變型熒光素酶報告基因（ Trx1(MtTRE)-Luc）和AP-1質(zhì)粒，選擇HEK293細胞進行共轉(zhuǎn)染，利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測TRE序列突變對于Trx1基因調(diào)控水平變化的影響。
　　結(jié)果：（1）慢病毒

4、感染星形膠質(zhì)細胞后，PT-PCR的結(jié)果顯示，與對照組相比，LV3-288的干擾效率最為顯著（p<0.01）。
　?。?）MTS和LDH的結(jié)果顯示，干擾Trx1可以導致OGD/R后星形膠質(zhì)細胞存活率的降低及細胞損傷程度的增加。RT-PCR和Western blot分析顯示，干擾Trx1可以降低2-Cys Prdxs的蛋白表達，而升高Prdx-SO3的表達。
　　（3）雙熒光素酶報告基因的結(jié)果顯示，和AP-1結(jié)合的序列TRE元件