基于納米基因傳遞系統(tǒng)的直接重編程：誘導(dǎo)分化成肝臟樣細(xì)胞的研究.pdf

1、近年來，肝癌成為了繼心腦血管疾病之后的又一威脅人類生命安全的重大疾病。我國的肝癌發(fā)病率一直居高不下，而肝臟移植仍是主要的治療手段。但由于肝源的短缺以及患者自身的生理狀況，術(shù)后的情況往往不是很理想?！凹?xì)胞替代治療法”概念的問世，給患者帶來了希望。但同樣的，肝細(xì)胞移植替代肝臟移植，供體肝細(xì)胞的來源仍是一個問題，即使是單純的獲取肝臟細(xì)胞，對人體也有很大的創(chuàng)傷性。本課題以磷酸鈣納米粒為基因載體，攜帶外源性的肝臟相關(guān)基因，體外直接重編程肝臟樣細(xì)胞

2、，高效地產(chǎn)生“供體肝臟細(xì)胞”，繼而解決肝臟細(xì)胞短缺的問題。全文主要由以下5個章節(jié)構(gòu)成。
　　第一章綜述
　　本章節(jié)主要圍繞肝癌的現(xiàn)狀（產(chǎn)生原因，臨床治療手段等），現(xiàn)階段對于體外肝臟樣細(xì)胞重編程的現(xiàn)狀以及目前對于基因載體的應(yīng)用的概括。為后續(xù)的研究提供理論依據(jù)。
　　第二章磷酸鈣納米粒的制備及表征
　　主要介紹攜帶外源性肝臟相關(guān)基因的磷酸鈣納米粒的制備及其理化性質(zhì)的表征。首先，通過瓊脂糖電泳法確定質(zhì)粒是否被磷酸鈣包裹

3、；隨后，采用粒徑分析儀和透射電鏡（TEM）分別測定所制備的磷酸鈣納米粒的粒徑大小，分布，Zeta電位以及微觀形態(tài)；最后，通過MTT法來考察納米粒的細(xì)胞毒性。
　　研究結(jié)果表明，掃描電鏡下觀測納米粒子呈現(xiàn)較均一的球形，平均粒徑在50nm左右，和粒徑分析儀的結(jié)果相符。Zeta電位在+3.89mV左右，與電泳圖的結(jié)果一致，細(xì)胞毒性試驗說明所制備的磷酸鈣納米粒是無毒或低毒的。
　　第三章人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的直接重編程
　　以人

4、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UC-MSCs）為種子細(xì)胞，進(jìn)行體外肝臟樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。首先，分別將已經(jīng)制備好的含質(zhì)粒的5種磷酸鈣納米粒進(jìn)行外源基因的瞬時轉(zhuǎn)染，連續(xù)轉(zhuǎn)染4次后，用3種誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別進(jìn)行細(xì)胞的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。采用酶聯(lián)免疫試劑盒（ELISA KIT）分別檢測細(xì)胞在第0天，7天，14天，21天，25天時AFP，ALB的表達(dá)情況，來確定最佳的質(zhì)粒組合以及培養(yǎng)基類型。
　　結(jié)果顯示：“最佳”的質(zhì)粒組合是Hnf4α,Foxa1,Foxa2,

5、Foxa3，“最佳”的培養(yǎng)基是mediumⅢ，即先對細(xì)胞給予高濃度的Activin A（100ng/mL），繼而添加a-FGF，TSA，HGF，EGF，Dex，OSM等有助于肝臟誘導(dǎo)分化為肝臟的物質(zhì)。細(xì)胞的表觀形態(tài)顯示，臍干細(xì)胞已由原來的長梭狀，變成類似的肝臟細(xì)胞多角形，細(xì)胞核突出，部分出現(xiàn)雙核現(xiàn)象。ELISA結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)的第7天左右，最大程度的表達(dá)AFP，并在14天左右，AFP不再表達(dá)。而ALB則在第14天左右才開始表達(dá)，且隨時間

6、的延長，表達(dá)量增加，直到25天左右，表達(dá)量趨于恒定。研究結(jié)果表明，通過實驗篩選肝臟直接重編程的最佳組合能成功使人臍帶干細(xì)胞直接重編程為肝細(xì)胞。
　　第四章大鼠胚胎成纖維細(xì)胞和小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞的直接重編程
　　主要是對上一章節(jié)建立的“最佳質(zhì)粒組合和培養(yǎng)基”的方法學(xué)進(jìn)行驗證，以大鼠胚胎成纖維細(xì)胞(REF)和小鼠神經(jīng)脊來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(EMSC)作為候選者，進(jìn)行體外肝臟樣細(xì)胞的直接重編程。通過SDS-PAGE蛋白電泳，免疫熒光，

7、ELISA試劑盒等實驗對肝臟的代表性功能進(jìn)行檢測，包括相關(guān)蛋白（AFP、ALB、CK18）的表達(dá)，合成尿素的量，消耗葡萄糖的量以及相關(guān)酶（AST、ALT、LDH）的活性，以進(jìn)一步驗證方法學(xué)的通用性。
　　結(jié)果顯示：REF和EMSC的形態(tài)均發(fā)生明顯的變化，都由原來的長梭形變成了橢圓形，部分細(xì)胞出現(xiàn)了“鋪路石”樣，且細(xì)胞核/胞漿的比值明顯變小，甚至出現(xiàn)雙核或者多核的現(xiàn)象。在誘導(dǎo)分化期間，Western Blot和細(xì)胞免疫熒光結(jié)果表明：

8、誘導(dǎo)分化組的肝臟相關(guān)特異性蛋白（AFP、ALB、CK18）的表達(dá)量較空白組均顯著表達(dá)，且尿素的合成量和葡萄糖的消耗量都隨著培養(yǎng)時間的延長而增加，呈現(xiàn)一定的時間依賴性。ELISA試劑盒檢測的AST，ALT和 LDH的含量都暗示著類肝臟細(xì)胞的活力在整個過程中都沒有很大的波動。研究表明，大鼠胚胎成纖維細(xì)胞核小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞均可直接重編程為具有肝臟相關(guān)特性的類肝臟細(xì)胞。
　　第五章3D體系下，EMSC的肝臟細(xì)胞的直接重編程
　　以E

9、MSC為種子細(xì)胞，選用殼聚糖和纖維膠原制備的支架材料，建立EMSC三維培養(yǎng)體系。采用掃描電鏡觀察支架的微觀形態(tài)以及細(xì)胞在支架上的生長狀態(tài)；MTT間接地考察EMSC在支架上的增值狀況。采用細(xì)胞免疫熒光法，化學(xué)檢測以及ELISA試劑盒等檢測肝臟相關(guān)蛋白（AFP、ALB、CK18），肝功能（尿素的合成，葡萄糖的消耗量）以及肝臟相關(guān)酶的活性（AST、ALT、LDH）檢測三維條件下肝細(xì)胞直接重編程效果，并與單層培養(yǎng)相比較。
　　結(jié)果顯示：掃

10、描電鏡下所制備的纖維膠原支架以及纖維膠原和殼聚糖的混合支架均呈現(xiàn)疏松多孔多層次的結(jié)構(gòu)，2種支架的孔徑均在100μm左右，且細(xì)胞很好的粘附在支架上。MTT實驗發(fā)現(xiàn)：由于三維體系的存在，單位面積中支架上培養(yǎng)的細(xì)胞的密度更大，且增殖更明顯。與二維細(xì)胞相比，三維培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后，肝臟相關(guān)因子（AFP，ALB，CK18）都高表達(dá)，且尿素合成，消耗葡萄糖的能力等肝功能活性都高于二維培養(yǎng)。肝臟相關(guān)酶活性的ELISA試劑盒顯示：殼聚糖/膠原支架的