槐耳通過lncRNA-H19抑制乳腺癌進(jìn)展的分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　乳腺癌是全球女性最為常見的惡性腫瘤之一，它也是女性患者中死亡率最高的癌癥類型。我國每年的女性乳腺癌新診斷病例數(shù)約占全世界的12.2％，因乳腺癌而死亡的女性患者約占全世界的9.6％。研究乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制，尋求安全有效的治療方法是臨床醫(yī)學(xué)工作者和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究人員迫切需要解決的問題。
　　近年來，隨著人們對“乳腺癌是一種全身性疾病”這一觀點的普遍接受，集手術(shù)治療、放療、化療、內(nèi)分泌治療、中醫(yī)藥治療、生

2、物治療、靶向治療等為一體的綜合性治療體系逐漸形成。隨著腫瘤學(xué)臨床研究和基礎(chǔ)研究的進(jìn)展，乳腺癌的各種療法無論在安全性還是在治療效果上都有所改進(jìn)，但近年來全球乳腺癌的發(fā)病率和死亡率仍在逐步上升，在臨床應(yīng)用中也存在諸多問題，例如價格昂貴、耐藥性的產(chǎn)生及全身毒副作用等。因此尋求一種毒副作用小、耐藥性低且安全有效的藥物應(yīng)用于乳腺癌的臨床治療是亟待解決的問題。中藥作為一種來源于藥用草本植物的天然藥物及其加工代用品，因其毒性相對較低、價格相對適中、療

3、效確切等優(yōu)點引起了醫(yī)學(xué)工作者的廣泛關(guān)注，逐漸成為乳腺癌系統(tǒng)性輔助治療中的重要組成部分。一些中藥制劑在癌癥的治療中可以增強(qiáng)患者對其他療法的敏感性，延長患者的生存期，提高機(jī)體免疫力及生活質(zhì)量，有良好的臨床應(yīng)用前景。
　　槐耳是一種生長在樹干上的棕褐色藥用真菌，在我國應(yīng)用于疾病治療已經(jīng)有一千六百余年的歷史。有越來越多的證據(jù)表明，槐耳在乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胃癌、宮頸癌、卵巢癌等多種癌癥類型中有良好的治療作用。我們團(tuán)隊在前期研究中證實了

4、槐耳清膏可以通過抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤血管新生、誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡及自嗜、調(diào)節(jié)腫瘤特異性免疫等多種機(jī)制發(fā)揮抗癌作用。對槐耳抗癌療效分子機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，槐耳對p53通路、pAKT/mTOR/S6通路、JNK/P38信號通路、ER/NF-kB通路、Wnt/β-catenin通路、PI3KK/AKT通路等重要的信號通路都有調(diào)控作用。然而，槐耳潛在治療機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。
　　長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類由200

5、個以上核苷酸組成的RNA分子。LncRNA雖然不具備蛋白質(zhì)編碼功能，但可以通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)、表觀遺傳學(xué)修飾等多種方式對基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而對多種人類疾病的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。近年來lncRNA在癌癥發(fā)生發(fā)展中的重要作用已被大量研究所證實，為lncRNA在臨床診斷和靶向治療中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。例如在前列腺癌中高特異性表達(dá)的新型前列腺癌抗原3（PCA3，又稱DD3），是最早發(fā)現(xiàn)的與癌癥相關(guān)的lncRNA之一，現(xiàn)已作為前列腺癌輔助診

6、斷的生物標(biāo)記分子應(yīng)用于臨床。因此對lncRNA在癌癥中發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制的研究具有重要意義。目前還沒有對lncRNA是否在槐耳的抗腫瘤功能中起介導(dǎo)作用的報道，因此我們從lncRNA入手探索槐耳抗癌作用的潛在機(jī)制，利用分子生物學(xué)技術(shù)，闡述槐耳清膏對乳腺癌細(xì)胞抑制作用的可能機(jī)制，為槐耳治療乳腺癌提供藥理學(xué)依據(jù)。
　　研究目的：
　　1.探討經(jīng)槐耳處理與未處理的乳腺癌細(xì)胞，利用基因芯片分析兩組細(xì)胞系中差異表達(dá)的基因;
　　

7、2.探討lncRNA-H19在槐耳的抗癌療效中發(fā)揮的作用和潛在的分子機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　本研究中使用的MDA-MB-231、MDA-MB-468和MCF-7乳腺癌細(xì)胞系均培養(yǎng)在含10％胎牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5％CO2環(huán)境中培養(yǎng)，2-3天傳一次代。
　　2.差異基因的分析
　　本研究中，我們利用接受與未接受槐耳處理的乳腺癌細(xì)胞提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)成cDNA，

8、送至Affymetrix公司進(jìn)行芯片雜交處理。我們利用該公司提供的專業(yè)分析軟件，分析該公司提供的原始數(shù)據(jù)，利用倍數(shù)法分析槐耳組和未接受槐耳組細(xì)胞系中差異表達(dá)的基因。
　　3.基因功能顯著性分析(G0分析):
　　將分析出的差異表達(dá)的基因與G0數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比，并對每個基因的功能進(jìn)行注釋，最終得到每個基因所參與的功能，基于每個G0功能中發(fā)生變化的基因數(shù)目以及Fisher檢驗差異顯著性的p值，挑選出變化最為顯著的20個G0功能，并

9、繪制G0功能的分布圖。
　　4.差異基因參與的信號通路分析(Pathway分析)
　　利用公司提供的專業(yè)軟件，基于KEGG信號通路數(shù)據(jù)庫，將每個基因所參與的信號傳導(dǎo)通路進(jìn)行注釋?；诿總€Pathway中發(fā)生變化的基因數(shù)目以及Fisher檢驗差異顯著性的p值，挑選出變化最為顯著的20個Pathway，并繪制Pathway的分布圖。
　　5.差異基因所參與通路的網(wǎng)絡(luò)分析
　　根據(jù)上述結(jié)果所示的差異基因及其所參與的通路

10、注釋，利用專業(yè)的分析軟件，繪制差異通路的網(wǎng)絡(luò)圖。其中紅色代表通路激活，藍(lán)色代表通路抑制，黃色代表通路中的基因既有上調(diào)也有下調(diào)。
　　6.實時定量PCR(qPCR)
　　我們利用Trizol處理乳腺癌細(xì)胞，提取總RNA，然后利用購買的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA或microRNA，進(jìn)行實時定量PCR(qPCR)實驗，分別檢測了槐耳提取物對lncRNA-H19和miR-675-5p表達(dá)水平的影響。
　　7.質(zhì)粒擴(kuò)增提

11、純
　　我們將lncRNA-H19的cDNA克隆至pcDNA3.1載體的多克隆位點，獲得lncRNA-H19的過表達(dá)質(zhì)粒。將適量質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的大腸桿菌，將其涂布到含氨芐抗生素的LB培養(yǎng)板上，過夜培養(yǎng)12-16h。挑取培養(yǎng)板上的單克隆菌落置于含氨芐抗生素的LB培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)使菌落擴(kuò)增，過夜培養(yǎng)1216h。利用購買的無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒的提取。
　　8.細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　將擴(kuò)增提純的lncRNA-H19過表達(dá)質(zhì)

12、粒、找生物技術(shù)公司合成的lncRNA-H19的siRNA或miR-675-5p的mimics和inhibitor，與一定量的脂質(zhì)體2000混合，按照操作程序加至細(xì)胞中，調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)量，以進(jìn)行后續(xù)的功能與機(jī)制研究。
　　9.MTT實驗
　　將經(jīng)過細(xì)胞轉(zhuǎn)染的乳腺癌細(xì)胞種到7個96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別經(jīng)槐耳處理0，1，2，3，4，5，6天后，向細(xì)胞中加入MTT溶液，利用酶標(biāo)儀讀取490nm處的吸光度值，從而檢測過表達(dá)或抑制l

13、ncRNA-H19和miR-675-5p對乳腺癌細(xì)胞槐耳提取物敏感性的影響。
　　10.流式細(xì)胞術(shù)
　　將經(jīng)過轉(zhuǎn)染和槐耳處理的細(xì)胞進(jìn)行Annexin V-FITC/PI染色，利用流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞的比例，從而檢測過表達(dá)或抑制lncRNA-H19和miR-675-5p是否對槐耳提取物誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的能力產(chǎn)生影響。
　　11.Western Blot
　　按照操作程序?qū)⒓?xì)胞裂解，提取細(xì)胞總蛋白。然后進(jìn)行SDS

14、-PAGE電泳，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育及二抗孵育處理，最后利用化學(xué)發(fā)光試劑顯示miR-675-5p的下游蛋白CBL的表達(dá)量以確定其是否在槐耳的抑癌功能中發(fā)揮介導(dǎo)作用。
　　研究結(jié)果：
　　1.我們的結(jié)果顯示，在經(jīng)過8mg/ml槐耳溶液刺激72h后，共有1116個lncRNAs發(fā)生了顯著的變化。其中有211個lncRNAs發(fā)生了上調(diào)，905個發(fā)生了下調(diào)。
　　2.G0分析顯示，在經(jīng)過槐耳刺激后，共有129個主要的G

15、0功能發(fā)生了變化，其中77個功能發(fā)生了上調(diào)，52個G0功能發(fā)生下調(diào);Pathway分析顯示，共有109個pathway發(fā)生了顯著改變，其中有59個發(fā)生了上調(diào)，50個發(fā)生了下調(diào);我們利用芯片數(shù)據(jù)構(gòu)建了槐耳作用的分子通路圖。
　　3.槐耳提取物可以降低lncRNA-H19和miR-675-5p的表達(dá)，過表達(dá)LncRNA-H19和miR-675-5p可以抑制槐耳提取物的細(xì)胞毒作用。
　　4.lncRNA-H19和miR-675-5

16、p表達(dá)水平的降低可以促進(jìn)槐耳提取物的抑癌作用，增加乳腺癌細(xì)胞對槐耳提取物的敏感性。
　　5.槐耳提取物處理乳腺癌細(xì)胞后能上調(diào)miR-675-5p下游蛋白CBL的表達(dá)水平。
　　研究結(jié)論：
　　1.槐耳具有多靶點的作用方式，可以通過抑制細(xì)胞周期進(jìn)展、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等多種途徑影響乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展。
　　2.槐耳可以對lncRNA的表達(dá)產(chǎn)生調(diào)控作用，槐耳可以通過lncRNA-H19/miR-675-5p/CBL途徑抑制