東海原甲藻增殖細胞核抗原基因表達量與生長關系的研究.pdf

1、浮游藻是海洋食物鏈的重要一環(huán)，在能量轉移和營養(yǎng)鹽循環(huán)等方面起著重要作用。對浮游藻現(xiàn)場生長率等基本生理生態(tài)學參數(shù)的測定，是估算浮游藻生產力、研究浮游藻種群變遷、構建生態(tài)動力學模型乃至赤潮預測的基礎，特別是現(xiàn)場測定單種浮游藻的生長率顯得尤為重要。但目前尚缺乏一種準確估算單一種類浮游藻現(xiàn)場生長率的方法。近年來，國際上對細胞周期標志物的研究顯示，增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)可能

2、在浮游藻生長率研究中有巨大的潛在應用價值，這為藻類生長率的估算提供了新的研究方向。 本研究以我國東海海域常見的赤潮藻-東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)為研究對象，首次克隆得到了東海原甲藻的PCNA基因和其細胞色素b基因的cDNA全長序列，分別設計了符合實時熒光定量PCR檢測要求的引物和TaqMan探針，建立了檢測東海原甲藻PCNA與Cytb基因的實時熒光定量PCR方法，系統(tǒng)研究了東海原甲藻PCNA基

3、因表達量在不同細胞周期中的變化及其與生長率之間的關系，為運用分子生物學技術實現(xiàn)東海原甲藻現(xiàn)場生長率的估算奠定了基礎。 主要研究結果如下： (1)通過反轉錄PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速擴增技術(RACE)，首次克隆得到了東海原甲藻長為1057bp的PCNA基因的cDNA全長序列和長為1124bp的細胞色素b(cytochrome b，Cyt b)基因的cDNA全長序列，并分別對PCNA和Cyt b進行了序列

4、比對和系統(tǒng)進化樹分析。 (2)根據(jù)得到的PCNA與Cyt b基因序列，分別設計了符合實時熒光定量PCR(RFQ-PCR)檢測要求的引物和TaqMan探針，并以12種藻為參照藻，對所設計PCNA基因的RFQ-PCR引物的特異性進行了分析。采用SYBR GreenⅠ染料和TaqMan探針兩種熒光體系建立了檢測東海原甲藻PCNA與Cyt b基因的實時熒光定量PCR的標準曲線。采用SYBR GreenⅠ染料體系得到的曲線方程分別為：對

5、PCNA，y=-3.403x+40.048，(r=0.999，其中x為細胞數(shù)對數(shù)值，y為CT值，r為相關系數(shù))；對Cyt b，y=-3.501x+39.351，(r=0.999)；采用TaqMan探針體系得到的曲線方程分別為：對PCNA，y=-3.211x+39.302，(r=0.999)；對Cyt b，y=-3.340x+41.041，(r=0.997)。通過對標準樣品的檢測，驗證了所建立標準曲線的準確性。 (3)運用建立的

6、定量PCR方法，系統(tǒng)研究了東海原甲藻PCNA基因表達量在不同細胞周期中的變化及其與生長率之間的關系。結果表明，Cyt b基因表達穩(wěn)定，平均單細胞表達量為(45.4±4.7)拷貝，在不同的生長階段表達量變化很小，是一個潛在的良好的內參基因。與此不同，平均單細胞中PCNA表達量在培養(yǎng)的不同階段變化較大，指數(shù)期的含量比平臺期高4倍左右，說明PCNA表達量與細胞分裂密切相關。以Cytb基因為內參基因，PCNA基因為目的基因，進一步研究了不同培養(yǎng)

7、條件下PCNA基因的相對表達量(REL)與生長率之間的關系，結果發(fā)現(xiàn)，REL與生長率呈正相關性。 (4)以流式細胞術分析了同步培養(yǎng)的東海原甲藻的細胞周期，以RFQ-PCR測定了PCNA基因表達量，研究了不同細胞周期中PCNA基因表達的變化。結果表明，同其他物種的PCNA類似，東海原甲藻PCNA表達與細胞周期相關，表達量從G1后期開始升高，在S期表達量最高。 本研究為建立PCNA相對表達量與東海原甲藻生長率之間的關系，