腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體及其受體DR5對動脈粥樣硬化斑塊形成的影響.pdf

1、論文Ⅰ腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體及其受體DR5對動脈粥樣硬化斑塊形成的影響
　　背景
　　TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand，腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體)，是腫瘤壞死因子超家族的成員之一，由Wiley等于1995年首次從表達序列標簽(Expressed sequence tag，EST)數(shù)據(jù)庫中分離和鑒定出來。TRAIL與Fas配體(FasL，Apo1L或CD95)和腫

2、瘤壞死因子-α(TNF-α)分別具有28％和23％的同源性。1996年研究者分離出由281個氨基酸組成、分子量為32.5kD的蛋白質(zhì)，因其與FasL具有較高的同源性，該研究將其命名為凋亡素配體2(apoptosis2-1igand，Apo2L)。隨后的研究發(fā)現(xiàn)Apo2L和TRAIL是同一種因子。
　　目前發(fā)現(xiàn)的TRAIL受體有5種:TRAIL-R1/DR4(death receptor4)、TRAIL-R2/DR5(death r

3、eceptor5)、TRAIL-R3/DcR1(decoy receptor1)、TRAIL-R4/DcR2(decoy receptor1)和骨保護素(osteoprotegerin，OPG)。按其功能和結構可分為三類:(1)死亡受體:DR4和DR5;(2)誘騙受體:DcR1和DcR2;(3)可溶性受體骨保護素。DR4和DR5分別由468和411個氨基酸殘基組成，二者有55％的同源性。TRAIL與這兩種受體結合后誘導敏感細胞的凋亡。小

4、鼠體內(nèi)僅有DR5的表達。
　　TRAIL除了誘導細胞凋亡的作用外，研究還發(fā)現(xiàn)TRAIL有調(diào)節(jié)細胞增殖、遷移、分化，調(diào)節(jié)免疫應答功能和免疫耐受機制的作用，以及參與調(diào)節(jié)干細胞的生理功能。TRAIL主要由免疫細胞生產(chǎn)（如自然殺傷T細胞和單核巨噬細胞），而TRAIL的受體在體內(nèi)是廣泛表達的。在血管中，TRAIL受體在平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞中均有表達。因此，越來越多的證據(jù)顯示TRAIL在調(diào)節(jié)正常血管生物學功能以及在血管疾病的發(fā)生中都可能具有重

5、要作用。TRAIL功能缺失實驗證實如果敲除TRAIL基因則導致ApoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化斑塊增大，提示內(nèi)源性的TRAIL可能對動脈粥樣硬化發(fā)生具有保護作用。最近，Michowitz等進行的一項臨床病例觀察研究中，結果顯示急性冠脈綜合癥病人血漿中可溶性TRAIL表達水平明顯低于穩(wěn)定性心絞痛和正常對照組，與C反應蛋白呈現(xiàn)負相關關系。該研究提示TRAIL對ACS患者斑塊的穩(wěn)定性可能起著一定的保護作用。根據(jù)這些研究結果人們提出TRAIL有

6、可能作為一種新的治療手段用于治療與動脈粥樣硬化相關的心血管疾病。
　　然而，TRAIL對動脈粥樣硬化的藥理作用的量效關系尚沒有被系統(tǒng)地詮釋，目前一個尚未澄清的重要科學問題是過量產(chǎn)生的或外源性給予的TRAIL是否具真的具有抗動脈粥樣硬化作用？值得注意的是，有不少證據(jù)顯示過高的TRAIL水平可能具有促進動脈粥樣硬化發(fā)生的作用。
　　例如，有研究報道，外源性TRAIL刺激可以增加血管平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞的炎癥反應，上調(diào)E-選擇素(

7、E-selectin)，細胞間粘附分子1(intercellular adhesionmolecule，(ICAM)-1)和白介素-8(interleukin(IL)-8)的表達。并且，在機體處于炎癥狀態(tài)下血漿TRAIL的水平呈升高趨勢，而慢性炎癥狀態(tài)是誘發(fā)動脈粥樣硬化的重要危險因素。雖然有一項研究報道在動脈粥樣硬化合并糖尿病的小鼠中TRAIL可能通過引起巨噬細胞的凋亡而減輕斑塊負荷，但這只是在晚期斑塊且合并糖尿病的情況下觀察到的，而且

8、晚期斑塊中巨噬細胞凋亡的增加還可能導致斑塊的不穩(wěn)定。因此，目前的研究證據(jù)還不足以證明給予外源性的TRAIL干預對動脈粥樣硬化，特別是早期的斑塊形成，是具有抑制作用還是促進作用。
　　目的
　　1.研究外源性TRAIL干預對動脈粥樣硬化斑塊形成的作用。
　　2.用雙敲基因小鼠模型進一步證實DR5受體在動脈粥樣硬化斑塊形成的作用。
　　3.研究TRAIL對早期斑塊和晚期斑塊不同影響背后的機制。
　　方法

9、　　1.實驗動物:8周齡雄性apoE-/-小鼠購自北京維通利華公司，8周齡雄性LDLR-/-小鼠購自南京大學模式動物研究所，DR5-/-小鼠購自美國Mutant Mouse RegionalResource Centers(MMRRC)。所有動物實驗均符合山東大學齊魯醫(yī)院倫理委員會對動物實驗的要求和規(guī)定。
　　2.TRAIL對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成的作用:將8周齡雄性apoE-/-小鼠分成正常對照組和TRAIL過表

10、達組，TRAIL過表達組給予重組TRAIL腹腔注射（3μg每只，每周一次），持續(xù)4周或8周。對照組注射等量生理鹽水。為了排除高脂飲食對TRAIL的影響，本研究設置普通或高脂飲食組。
　　3.TRAIL對LDLR-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成的作用:將8周齡雄性apoE-/-小鼠或LDLR-/-小鼠給予高脂飲食8周，然后在繼續(xù)高脂飲食的基礎上，分成正常對照組和TRAIL過表達組，TRAIL過表達組給予重組TRAIL腹腔注射(3μg每

11、只，每周一次)8周。對照組注射等量生理鹽水。
　　4.DR5-/-apoE-/-小鼠模型構建:8周齡apoE-/-和DR5-/-小鼠按照一雄兩雌進行交配繁殖，雜一代基因型均為DR5+/-apoE+/-，雜一代在8周齡時繼續(xù)進行交配繁殖，后代經(jīng)鼠尾組織DNA提取，PCR擴增后產(chǎn)物電泳分析后分出DR5-/-apoE-/-和DR5+/+apoE-/-小鼠。
　　5.組織樣本采集:各組小鼠均禁食過夜，應用0.8％戊巴比妥鈉麻醉后從心

12、尖抽取血液。小鼠安樂死后，分別收集心臟、血管、肝臟等組織。用于分子生物學研究如檢測mRNA、蛋白表達等的的組織樣本，待分離后置于組織凍存管，迅速放在液氮中防止其裂解，后保存于-80℃?zhèn)溆谩Ｓ糜谥苽浔鶅龌蚴炃衅⒊Ｒ?guī)染色、組化等研究的組織則置于4％多聚甲醛中4℃固定過夜，后置于1×PBS溶液中。
　　6.血脂水平檢測:從小鼠心尖抽取血液并分離血漿，并檢測血漿中總膽固醇(TC)、總甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度

13、脂蛋白(HDL-C)和血糖水平。
　　7.組織學染色以及免疫組織化學染色:主動脈根部組織切片進行HE染色觀察形態(tài)，進行油紅O染色反映斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量，進行Masson染色來評估膠原含量。各指標的蛋白表達情況應用相應的免疫組織化學染色檢測，TUNEL染色檢測斑塊內(nèi)細胞凋亡。
　　8.外周血單核細胞表型檢測:8周齡雄性apoE-/-小鼠，外源性TRAIL過表達干預2周（對照組注射等量生理鹽水）。取外周血，免疫磁珠分選出CD115+

14、單核細胞，流式細胞術檢測細胞表面CD11b、Ly6C/Gr1、CCR2、CCR5、CX3CR1的表達。
　　9.細胞凋亡檢測:主動脈根部切片及細胞爬片應用TUNEL染色檢測細胞凋亡;懸浮細胞應用AnnexinⅤ-FITC流式細胞術檢測細胞凋亡。
　　10.統(tǒng)計學分析:定量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，兩組之間比較采用獨立樣本的t檢驗;多組之間比較采用one-way ANOVA檢驗及q檢驗。設P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　

15、　結果
　　1.外源性TRAIL干預促進高脂血癥小鼠斑塊的生長
　　大體油紅O染色提示早期TRAIL過表達組小鼠的自主動脈弓、胸主動脈、腹主動脈至髂總動脈斑塊面積明顯高于生理鹽水對照組，并且TRAIL促進斑塊生長的作用不受小鼠飲食的影響。橫截面切片分析也證實，TRAIL過表達組小鼠主動脈根部的斑塊明顯高于生理鹽水對照組。
　　2.外源性TRAIL干預不改變apoE-/-小鼠外周血單核細胞表型
　　為了闡明TRAI

16、L是否在外周血單核細胞遷移至血管壁之前就影響其表型，本研究在外源性TRAIL干預2周后，取apoE-/-小鼠外周血CD115+單核細胞，并證實＞90％的細胞為CD11b+。與對照組相比，外源性TRAIL干預并不影響CD11b+單核細胞表面Ly6C/Gr1、CCR2、CCR5、CX3CR1的表達，提示TRAIL干預引起ApoE-/-小鼠斑塊的生長并不依賴于改變外周血單核細胞的表型。
　　3.外源性TRAIL干預引起血管炎癥反應

17、>　　為了研究TRAIL是否引起apoE-/-小鼠血管炎癥反應，分離出apoE-/-小鼠的主動脈（升主動脈至髂總動脈）組織進行PCR，檢測炎癥指標的表達。結果顯示，TRAIL干預組血管組織中炎癥因子MCP-1，RANTES，VCAM-1和ICAM-1的表達較對照組顯著升高，而對CX3CL1的表達沒有影響，并且這種作用不受飲食的影響。另外，TNF-α、E-選擇素和IL-1也有明顯升高。這些證據(jù)證實，外源性TRAIL干預引起了apoE-/-

18、小鼠血管炎癥反應。應用MCP-1和RANTES的中和抗體合并TRAIL對apoE-/-小鼠進行干預。結果顯示，TRAIL導致的斑塊增大作用能夠被MCP-1/RANTES中和抗體阻斷
　　4.TRAIL促進斑塊的生長依賴于受體DR5
　　為了驗證TRAIL的促斑塊生長作用是否依賴于其受體DR5，我們將DR5-/-apoE-/-和DR5+/+apoE-/-小鼠分別高脂喂養(yǎng)8周后比較。大體油紅O染色顯示DR5-/-apoE-/-小

19、鼠的主動脈弓，胸主動脈，腹主動脈和髂總動脈處斑塊較DR5+/+apoE-/-小鼠明顯減少。橫截面切片分析也證實，DR5-/-apoE-/-小鼠主動脈根部的斑塊明顯低于DR5+/+apoE-/-小鼠。而外源性給予DR5-/-apoE-/-小鼠TRAIL干預后，斑塊面積也沒有顯著變化。
　　5.TRAIL引起斑塊內(nèi)巨噬細胞凋亡并和細胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激狀態(tài)相關
　　以往研究發(fā)現(xiàn)TRAIL可減小糖尿病小鼠晚期斑塊的面積，提示TRAIL可

20、能對早期和晚期斑塊有不同的作用。我們通過文獻研究發(fā)現(xiàn)早期斑塊和晚期斑塊中巨噬細胞的一個不同點是晚期斑塊的巨噬細胞可能存在明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應（ER stress）?；谝陨蠁栴}，我們提出假設:晚期斑塊中巨噬細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應能通過上調(diào)DR5受體的表達增加巨噬細胞對TRAIL誘導凋亡作用的敏感性。
　　通過TUNEL染色，我們觀察到，在apoE-/-小鼠斑塊形成早期（8周），TRAIL并沒有引起斑塊內(nèi)細胞凋亡的顯著增加，而到了斑塊

21、形成晚期（16周），較對照組而言，外源性TRAIL引起明顯的斑塊內(nèi)細胞凋亡的增加。體外實驗證實，TRAIL主要引起巨噬細胞的凋亡。
　　我們檢測了早期斑塊（8周）和晚期斑塊（16周）中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應的水平，發(fā)現(xiàn)在晚期斑塊中CHOP和GPR78的表達水平明顯升高。在體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細胞（RAW264.7）和人單核巨噬細胞(THP-1)中觀察用衣霉素（tunicamycin，Tm）處理誘導產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激后，DR5、CHOP和GPR7

22、8表達升高，TRAIL引起的凋亡反應增強。
　　為明確ER stress上調(diào)DR5表達的分子生物學機制，根據(jù)以往文獻報道，CHOP蛋白可能與DR5的啟動子(promoter)結合，直接調(diào)控DR5的轉錄水平。我們用siRNA抑制CHOP的表達，發(fā)現(xiàn)Tm誘導DR5表達增加的作用被抑制了（圖41）;同樣我們應用siRNA抑制CHOP、DR5的表達，TRAIL引起的細胞凋亡也相應減少。最后我們利用染色質(zhì)免疫沉淀(CHIP)的方法檢測到CH

23、OP和DR5的啟動子區(qū)域直接結合，tunicamycin處理后CHOP的結合增多。
　　結論
　　(1)外源性TRAIL干預可顯著加重高脂血癥小鼠AS的病變，并且不受飲食方式的改變的影響。
　　(2) TRAIL是通過引起apoE-/-小鼠血管組織固有細胞的炎癥反應而不是改變血液中單核細胞的表型起到促AS形成的作用。
　　(3)動脈粥樣硬化晚期斑塊中巨噬細胞存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通過上調(diào)DR5受體的表達增加巨

24、噬細胞對TRAIL誘導凋亡作用的敏感性。這種機制可能解釋為什么TRAIL對晚期斑塊內(nèi)巨噬細胞的致凋亡作用與早期斑塊的不同。
　　論文Ⅱ腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)對血管細胞炎癥反應及巨噬細胞攝取脂質(zhì)的影響
　　背景
　　動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是由多種病因?qū)е碌氖及l(fā)于動脈壁內(nèi)膜的一系列復雜細胞和分子改變的總結果。
　　目前比較公認的是AS發(fā)生的慢性炎癥假說。研究指出AS病

25、變是一種具備慢性炎癥反應特征的病理過程:AS的發(fā)展過程在正常情況下實際上是一種血管壁內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞損傷的保護反應。在這個過程炎癥反應是始終伴隨著的，而當反應過度時就演變?yōu)榧膊顟B(tài)進而導致動脈粥樣硬化發(fā)生。
　　動物實驗證明，AS病變的形成主要與三個過程有關:(1)內(nèi)皮細胞的損傷，平滑肌細胞的增生、淋巴細胞及巨噬細胞浸潤，釋放炎癥及趨化因子;(2)由平滑肌細胞分泌膠原纖維、彈性纖維蛋白等結締組織基質(zhì)的形成;(3)脂質(zhì)（包括游離

26、的以及被修飾的脂蛋白）在基質(zhì)和泡沫細胞中的聚積。
　　慢性炎癥狀態(tài)是誘發(fā)動脈粥樣硬化的重要危險因素。炎癥因子促進動脈粥樣硬化炎癥的發(fā)生可能通過兩條途徑:改變血液中免疫細胞（主要是單核細胞）的表型和功能促進血管炎癥發(fā)生;改變血管組織本身固有細胞的炎癥反應。在前期試驗中我們在apoE-/-小鼠中檢測了TRAIL干預對外周血CD115+/CD11b+單核細胞表型的影響，發(fā)現(xiàn)TRAIL對外周血單核細胞表型變化的影響不顯著，而血管組織中炎癥

27、因子的表達顯著增加。
　　在體外培養(yǎng)的人肺動脈和主動脈中層平滑肌細胞中，可檢測到有TRAILmRNA及蛋白的表達，同時也可有死亡受體的表達。Sato等通過檢測人頸動脈斑塊中的平滑肌細胞，證實DR4、DR5和Fas受體均有表達，DR4的表達相對微弱，而DR5、FasL的表達非常高。免疫組織化學顯示位于斑塊纖維帽區(qū)域的VSMC表達DR5，而正常頸動脈壁不表達。
　　在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，游走于內(nèi)膜下的巨噬細胞吞噬脂質(zhì)（

28、尤其是各種被修飾的脂蛋白）從而轉變?yōu)榕菽毎菢O其重要的一環(huán)，是斑塊形成的起始。研究證實，巨噬細胞吞噬脂質(zhì)主要是通過其表面的清道夫受體(scavengerreceptors，SRs)實現(xiàn)的。巨噬細胞表面的清道夫受體主要包括:A型清道夫受體（SR-AⅠ和SR-AⅡ）、B型清道夫受體(SR-BⅠ)、CD36和LOX-1。然而，TRAIL是否影響巨噬細胞表面的清道夫受體的表達從而影響其脂質(zhì)吞噬的過程至今未有報道。
　　肥胖可以增加動脈粥

29、樣硬化的風險，其中脂肪因子(adipokines)被認為是脂肪調(diào)節(jié)心血管生理和病理的關鍵信使分子。脂肪組織可產(chǎn)生多種脂肪因子如TNF-α、白介素等，可由脂肪細胞或脂肪間質(zhì)細胞產(chǎn)生。TRAIL是TNF家族的成員之一，那么是否也可作為脂肪因子由脂肪組織生產(chǎn)？
　　基于以上研究，我們提出假說:TRAIL可能影響血管細胞的炎癥反應;TRAIL可能通過影響巨噬細胞表面清道夫受體的表達進而影響巨噬細胞的脂質(zhì)吞噬，從而影響AS斑塊的進程;TRA

30、IL可能作為脂肪因子由脂肪組織產(chǎn)生并參與肥胖伴隨的動脈粥樣硬化。
　　目的
　　1.研究TRAIL對內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞及巨噬細胞炎癥反應的影響。
　　2.研究TRAIL對巨噬細胞脂質(zhì)吞噬的影響。
　　3.探討TRAIL在肥胖伴隨的動脈粥樣硬化形成中的作用。
　　方法
　　1.細胞培養(yǎng):HUVEC為人臍靜脈內(nèi)皮細胞，以ECM（含10％胎牛血清、1％青霉素/鏈霉素、1％生長因子）貼壁培養(yǎng)。RAW264.

31、7細胞為小鼠巨噬細胞，以高糖DMEM（含10％胎牛血清、1％青霉素/鏈霉素）貼壁培養(yǎng)。THP-1細胞為人單核/巨噬細胞，以RPMI-1640（含10％胎牛血清、1％青霉素/鏈霉素）懸浮培養(yǎng)。小鼠血管平滑肌細胞以酶消化法自C57小鼠血管組織中分離，以高糖DMEM(含10％胎牛血清、1％青霉素/鏈霉素)貼壁培養(yǎng)。
　　2.細胞炎癥反應檢測:HUVEC、RAW264.7及小鼠原代平滑肌細胞分別以TRAIL(10ng/ml)、TNF-α(

32、20ng/ml)刺激6、12、24小時。收集細胞，提取細胞總mRNA，應用RT-PCR的方法檢測intercellular adhesion molecule(ICAM)-1、vascular cell adhesion molecule(VCAM)-1、 monocyte chemoattractant protein(MCP)-1、E-selectin等炎癥因子的表達。
　　3.巨噬細胞表面清道夫受體表達測定:RAW264.7

33、和THP-1細胞分別以TRAIL0.1、1、10和100ng/ml的濃度刺激24小時，然后選擇最佳濃度刺激細胞2、4、8、16和24小時以檢測時間依賴性。收集細胞，提取細胞總mRNA，應用RT-PCR的方法檢測SR-AⅠ、SR-BⅠ、CD36、LOX-1清道夫受體的表達。
　　4.巨噬細胞脂質(zhì)吞噬功能測定:RAW264.7和THP-1細胞種于八孔腔室玻片，THP-1細胞以phorbol myristate acetate(PMA，

34、100 nM)誘導分化。細胞以TRAIL刺激后，將DiI標記的乙?；兔芏戎鞍?DiI-Ac-LDL)(30μg/ml)加入培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)2-8小時，然后將細胞固定、染核，于激光共聚焦顯微鏡觀察熒光強度以檢測細胞對DiI-Ac-LDL的吞噬能力;RAW264.7細胞以TRAIL刺激后，將ox-LDL(80μg/ml)加入培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，然后將細胞固定，應用0.3％油紅O染色，蘇木素染核，光學顯微鏡下觀察細胞內(nèi)脂質(zhì)含量以

35、觀察泡沫細胞的形成情況。
　　5.為了闡明TRAIL主要通過哪種清道夫受體起作用，本研究應用SR-AⅠ抑制劑poly(I∶C)、SR-AⅠ siRNA、SR-BⅠ抑制劑BLT-1分別抑制RAW264.7和THP-1細胞表面SR-AⅠ和SR-BⅠ的作用，然后再以TRAIL刺激細胞，觀察細胞的脂質(zhì)吞噬。
　　6.為確定TRAIL影響泡沫細胞形成是否通過結合DR5受體，本研究提取野生型C57BL/6小鼠和DR5-/-小鼠腹腔巨噬細

36、胞，分別以TRAIL刺激，應用0.3％油紅O染色以觀察泡沫細胞的形成情況。
　　7.TRAIL細胞通路因子的測定:RAW264.7和小鼠原代平滑肌細胞分別以TRAIL(10ng/ml)、TNF-α(20ng/ml)刺激5、10、20、30、60及120分鐘，收集細胞，提取細胞總蛋白，應用western-blot的方法檢測ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、JNK、p-JNK、FADD、TRAF2等信號蛋白的表達以檢

37、測TRAIL與受體結合后對細胞通路的激活。應用UPSTATE(@) Non-Radioactive Universal EZ-TFATranscription Factor Assay試劑盒檢測NF-kB的激活。
　　8.為了闡明TRAIL引起的炎癥反應及脂質(zhì)吞噬所激活的細胞通路，本研究分別應用ERK抑制劑U0126，p38抑制劑SB202190，JNK抑制劑JNK InhibitorⅡ和NF-kB抑制劑Wogonin將細胞通路阻

38、斷，再用TRAIL刺激細胞，觀察細胞的炎癥反應及脂質(zhì)吞噬。
　　9.檢測ob/ob肥胖小鼠及Ⅱ型糖尿病大鼠血漿及脂肪組織中TRAIL的表達，與正常C57BL/6小鼠及Wistar大鼠相比較。免疫組化的方法檢測ob/ob小鼠、Ⅱ型糖尿病大鼠內(nèi)臟脂肪、人心包脂肪組織中TRAIL蛋白表達。
　　10.統(tǒng)計學分析定量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，應用雙側t檢驗或one-wayANOVA檢驗。設P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　結果

39、
　　1 TRAIL上調(diào)平滑肌細胞、巨噬細胞炎癥因子的表達
　　TRAIL(10 ng/ml)刺激血管平滑肌細胞后，自6小時起ICAM-1表達上調(diào)，12小時后ICAM-1、VCAM-1與對照組相比表達顯著增高，MCP-1的表達也在24小時后上調(diào)。以TRAIL刺激RAW264.7細胞，在6小時后MCP-1、VCAM-1的表達上調(diào)。而TRAIL對內(nèi)皮細胞炎癥因子的表達沒有影響，以終濃度10 ng/ml的TRAIL刺激HUVEC細

40、胞24小時，E-選擇素、ICAM-1、VCAM-1的表達與對照組相比，差別均無統(tǒng)計學意義。
　　2 TRAIL引起細胞的炎癥反應依賴于p38或NF-kB的激活
　　與TNF-α類似，TRAIL在平滑肌細胞和巨噬細胞中均能夠激活MAPK通路。TRAIL刺激平滑肌細胞20分鐘后，ERK1/2、p38、JNK的磷酸化水平升高，持續(xù)120分鐘。同樣，TRAIL刺激RAW264.7細胞20分鐘后，ERK1/2、JNK的磷酸化水平升高，

41、p-p38的水平自10分鐘起就開始升高，并持續(xù)120分鐘。應用U0126預處理細胞后，TRAIL仍然能夠引起平滑肌細胞的炎癥因子表達增高;應用JNK InhibitorⅡ預處理細胞后，TRAIL導致的VCAM-1表達增高的反應被抑制，而MCP-1、ICAM-1的表達仍上調(diào);而應用SB202190或Wogonin預處理細胞，TRAIL引起的MCP-1、ICAM-1、VCAM-1表達增高的反應均被抑制。
　　3 TRAIL可增加巨噬細

42、胞的脂質(zhì)吞噬和泡沫細胞的形成
　　TRAIL(10ng/ml)刺激RAW264.7細胞24小時，在培養(yǎng)基中加入DiI-Ac-LDL4小時后，TRAIL刺激組RAW264.7細胞內(nèi)紅色平均熒光強度顯著高于對照組，至8小時時達到高峰。10ng/ml TRAIL刺激THP-1細胞24小時后（THP-1細胞提前24小時以100ng/ml PMA誘導分化），在培養(yǎng)基中加入DiI-Ac-LDL，細胞內(nèi)平均熒光強度在8小時后明顯高于對照組。

43、r>　　同樣以10ng/ml TRAIL刺激RAW264.7細胞和THP-1細胞24小時后(THP-1細胞提前24小時以100ng/ml PMA誘導貼壁)，在培養(yǎng)基中加入ox-LDL，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，油紅O染色顯示，TRAIL刺激組細胞內(nèi)脂質(zhì)含量顯著高于對照組。
　　4 TRAIL促進泡沫細胞形成的過程依賴于DR5
　　為了證明TRAIL促進巨噬細胞脂質(zhì)吞噬是否通過結合受體DR5實現(xiàn)的，我們分別提取了DR5-/-及野生型（

44、DR5+/+）小鼠的腹腔原代巨噬細胞，以TRAIL刺激后觀察其吞噬ox-LDL的變化。DR5+/+巨噬細胞經(jīng)TRAIL刺激后，細胞內(nèi)脂質(zhì)含量顯著增加，而DR5-/-巨噬細胞經(jīng)TRAIL刺激后，細胞內(nèi)脂質(zhì)含量較對照組無明顯差別。
　　5 TRAIL上調(diào)巨噬細胞表面清道夫受體SR-AⅠ、SR-BⅠ的表達
　　以0.1、1、10、100 ng/ml的TRAIL刺激RAW246.7細胞24小時，SR-AⅠ和SR-BⅠ的表達顯著增高，

45、以10ng/ml的濃度達到最大效應。而CD36和LOX-1的表達較對照組差別無統(tǒng)計學意義。然后以10ng/ml的濃度刺激RAW246.7細胞2、4、8、16、24小時，結果顯示，TRAIL刺激組SR-AⅠ和SR-BⅠ表達持續(xù)升高，在24小時時達到高峰。最后以10ng/ml TRAIL刺激RAW246.7細胞24小時，TRAIL刺激組SR-AⅠ蛋白表達顯著高于對照組。
　　以1、10、100 ng/ml的TRAIL刺激THP-1細胞

46、24小時，SR-AⅠ和SR-BⅠ的表達顯著增高，以10ng/ml的濃度達到最大效應。而CD36和LOX-1的表達較對照組差別無統(tǒng)計學意義。以10ng/ml TRAIL刺激細胞24小時，SR-AⅠ的蛋白表達顯著高于對照組。
　　為了證明TRAIL上調(diào)SR-AⅠ和SR-BⅠ的表達是否是DR5受體依賴的，我們同樣提取了DR5-/-及野生型（DR5+/+）小鼠的腹腔原代巨噬細胞，以TRAIL刺激后觀察SR-AⅠ和SR-BⅠ表達的變化。DR

47、5+/+巨噬細胞經(jīng)TRAIL刺激后，SR-AⅠ和SR-BⅠ的表達顯著增加，而DR5-/-巨噬細胞經(jīng)TRAIL刺激后，SR-AⅠ和SR-BⅠ的表達較對照組無明顯差別。
　　6 TRAIL增加巨噬細胞的脂質(zhì)吞噬依賴于SR-AⅠ
　　應用SR-BⅠ抑制劑BLT-1(5μM)預處理細胞2小時后， TRAIL(10ng/ml)刺激24小時仍能增強RAW246.7細胞和細胞THP-1細胞吞噬DiI-Ac-LDL的能力。而應用SR-A抑制

48、劑poly(I∶C)(1μM)預處理后，RAW246.7細胞和細胞THP-1細胞經(jīng)TRAIL刺激其吞噬DiI-Ac-LDL卻沒有增加。以上結果提示，TRAIL增加巨噬細胞的脂質(zhì)吞噬可能依賴于SR-AⅠ。為了進一步驗證，我們合成了SR-AⅠsiRNA，轉染RAW246.7細胞后，SR-AⅠ的mRNA和蛋白表達較基礎水平下降70％，TRAIL(10ng/ml)刺激后表達也不再升高。與抑制劑作用相同，轉染SR-AⅠsiRNA后TRAIL也不能

49、促進RAW246.7細胞吞噬Ac-LDL。
　　7 TRAIL引起巨噬細胞脂質(zhì)吞噬增加依賴于p38或NF-kB的激活
　　應用U0126和JNK InhibitorⅡ預處理細胞后，TRAIL仍然能夠引起RAW246.7細胞的SR-AⅠ表達增高;而應用SB202190或Wogonin預處理細胞，TRAIL引起的SR-AⅠ表達增高的反應均被抑制，這些結果提示，TRAIL引起細胞的SR-AⅠ表達增高及脂質(zhì)吞噬反應也依賴于p38或N

50、F-kB的激活。
　　8 TRAIL在肥胖動物的脂肪組織及血清中表達增高
　　ob/ob肥胖小鼠血漿中TRAIL的含量顯著高于野生型小鼠，脂肪組織中TRAIL mRNA的表達也顯著增高。Ⅱ型糖尿病大鼠脂肪組織中TRAIL mRNA的表達水平與對照Wistar大鼠相比顯著增高。然后，我們應用免疫組化的方法檢測了小鼠、大鼠和人心包脂肪組織的TRAIL蛋白表達，結果顯示，脂肪的間質(zhì)細胞（stromal cell），而并非脂肪細胞本