薄荷醇通過P糖蛋白對丹參素腸吸收影響的研究.pdf

1、目的：
　　擬用薄荷醇作為中藥促進(jìn)劑的代表，分別從細(xì)胞和整體水平探討薄荷醇對丹參素腸吸收的影響，并通過 Caco-2單層細(xì)胞模型研究薄荷醇影響丹參素腸吸收與P糖蛋白（P-gp）之間的關(guān)系，探究薄荷醇促進(jìn)藥物腸吸收的初步機(jī)制。
　　方法：
　　1.外翻腸囊模型的腸吸收實(shí)驗(yàn)
　　體外培養(yǎng)建立大鼠外翻腸囊模型，實(shí)驗(yàn)大鼠分組：空白組，維拉帕米陽性對照組，20、40、80μg/mL丹參素組；選擇最佳吸收給藥濃度分別加入體積

2、比：0.1％、0.3%、0.9%薄荷醇組。采用高效液相色譜儀測定不同濃度丹參素的腸吸收情況，并測定了在薄荷醇干預(yù)情況下丹參素腸吸收的程度變化。
　　2. Caco-2單層細(xì)胞模型的建立
　　取處于對數(shù)生長期的Caco-2細(xì)胞，采用Transwell嵌套板，將吹打后混勻的細(xì)胞懸液鋪于上層膜上培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液。觀察細(xì)胞形態(tài)，并利用電阻測定儀檢測細(xì)胞間跨膜電阻作為單層細(xì)胞模型建立成功的依據(jù)。
　　3．MTT藥物濃度毒性實(shí)

3、驗(yàn)
　　采用MTT法，用CCK-8試劑盒對Caco-2細(xì)胞模型進(jìn)行藥物毒性實(shí)驗(yàn)，使用酶標(biāo)儀測定OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率并確定藥物給藥濃度。
　　4.Caco-2單層模型的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)
　　體外培養(yǎng)建立 Caco-2單層細(xì)胞模型，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組：空白組，維拉帕米陽性對照組，10、20、40、60μM丹參素組；選擇吸收較好的兩組加入：2、8、16μM（低、中、高）薄荷醇組。采用高效液相色譜儀測定不同濃度丹參素轉(zhuǎn)運(yùn)后的藥物濃度，

4、并測定在薄荷醇影響下丹參素轉(zhuǎn)運(yùn)濃度的變化。
　　5.細(xì)胞底物積累和外排實(shí)驗(yàn)
　　體外培養(yǎng)建立 Caco-2單層細(xì)胞模型，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為：空白組，維拉帕米陽性對照組，40μM丹參素組，2、8、16μM（低劑量組、中劑量組和高劑量組）薄荷醇組以及丹參素-薄荷醇混合溶液組和丹參素-維拉帕米混合溶液組。采用多功能酶標(biāo)儀測定了熒光強(qiáng)度和總蛋白含量，結(jié)果用熒光強(qiáng)度/mgpro表示，可以間接反映Rh123在Caco-2細(xì)胞里的含量。

5、　　結(jié)果：
　　1.翻腸囊模型腸吸收試驗(yàn)
　　外翻腸囊模型腸吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，丹參素在40μg/mL的給藥濃度下累積吸收量最好，為最佳濃度。在加入0.1%薄荷醇之后，吸收速率和累積吸收量明顯上升；在加入0.9%薄荷醇之后，吸收速率反而下降，累積吸收量無明顯變化。
　　2. Caco-2細(xì)胞模型的驗(yàn)證
　　Caco-2細(xì)胞在培養(yǎng)過程中融合度變高，電阻值也逐漸升高，直至21天左右形成致密的單層細(xì)胞膜，測定細(xì)胞間跨膜電

6、阻值大于400Ω/cm2。
　　3.丹參素、薄荷醇和維拉帕米給藥濃度的確定
　　細(xì)胞藥物毒性實(shí)驗(yàn)顯示，丹參素在給藥濃度不高于50μM時(shí)，Caco-2細(xì)胞存活率>90%；薄荷醇在給藥濃度不高于16μM時(shí)，Caco-2細(xì)胞存活率>90%，維拉帕米在給藥濃度不高于30μM時(shí)，Caco-2細(xì)胞存活率>90%，以此作為丹參素、薄荷醇和維拉帕米的敏感給藥濃度。丹參素和薄荷醇混合溶液在丹參素給藥濃度低于50μM、薄荷醇給藥濃度低于16μM

7、時(shí)，Caco-2細(xì)胞存活率>90%；丹參素和維拉帕米混合溶液在丹參素給藥濃度低于40μM、維拉帕米給藥濃度低于30μM時(shí)，Caco-2細(xì)胞存活率>90%。
　　4. Caco-2單層細(xì)胞模型轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)
　　細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，丹參素在35μM、40μM給藥濃度下滲透系數(shù)好，吸收程度較好。薄荷醇在給藥濃度為2μM時(shí)，丹參素的滲透系數(shù)明顯提升，轉(zhuǎn)運(yùn)率明顯升高；在給藥濃度為16μM時(shí)，丹參素的滲透系數(shù)沒有明顯變化，轉(zhuǎn)運(yùn)率有下降趨勢

8、；丹參素的轉(zhuǎn)運(yùn)速率隨著維拉帕米給藥濃度的升高而上升，成濃度依賴性。
　　5.薄荷醇對丹參素腸吸收的影響和P-gp的關(guān)系
　　細(xì)胞累積實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Caco-2細(xì)胞中 Rh123的累積量不隨著薄荷醇給藥濃度而改變，在低濃度時(shí)明顯高于空白組（只有丹參素）（P<0.05）,在高濃度時(shí)則無明顯變化（P>0.05）；細(xì)胞外排實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，薄荷醇組Caco-2細(xì)胞中Rh123的外排量在低濃度時(shí)明顯增加（P<0.05），高濃度時(shí)反而無明顯

9、變化（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.低濃度的薄荷醇可以促進(jìn)丹參素的腸吸收，而高濃度的薄荷醇可能對丹參素腸吸收有抑制作用；
　　2.低濃度的薄荷醇可以增強(qiáng)Caco-2細(xì)胞對P-gp底物的積累，減少外排；高濃度的薄荷醇則對Caco-2細(xì)胞對P-gp底物的積累和外排無明顯影響；
　　3.薄荷醇影響丹參素的腸吸收機(jī)制與 P-gp表達(dá)有著密切關(guān)聯(lián)，低濃度的薄荷醇有可能抑制Caco-2細(xì)胞內(nèi)P-gp表達(dá)從而促進(jìn)丹參素