TRIM66在非小細胞肺癌中過表達并促進腫瘤的惡性發(fā)展.pdf

1、目的:肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其致死率居高不下。目前針對肺癌的治療方法主要包括外科治療，化學治療和放射治療。但化療一般難以達到治愈非小細胞肺癌的效果。而放射治療過程中往往會發(fā)生放療抵抗現(xiàn)象，成為限制放療效果的關鍵因素。因此尋找和鑒定肺癌的分子標記物，對于早期診斷、治療以及判斷肺癌的預后情況十分重要。TRIM(tripartite-motif protein)蛋白家族成員通常具備E3泛素連接酶活性，在細胞的各項生理過程中發(fā)揮多樣性的生

2、物學功能。越來越多的研究表明TRIM家族蛋白在生物體發(fā)展過程中獨有的非常重要的作用，該家族蛋白的異常表達可能誘發(fā)多種類型的疾病，包括發(fā)育障礙，免疫系統(tǒng)疾病甚至是惡性腫瘤。TGF-β是生物體內(nèi)一種擁有多種功能的活性細胞因子。Smad蛋白是細胞內(nèi)重要的TGF-β信號轉導和調(diào)節(jié)因子。TGF-β/Smad信號轉導通路的異常與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關。最近有研究顯示，骨肉瘤組織中TRIM66的表達水平顯著高于正常組織，并且TRI

3、M66過表達與患者較高的局部復發(fā)率，淋巴結轉移以及較短的生存期密切相關。在骨肉瘤細胞中沉默TRIM66能夠明顯抑制TGF-β/Smad信號通路，提示TRIM66可能通過TGF-β/Smad調(diào)節(jié)腫瘤細胞侵襲。然而，在非小細胞肺癌中，TRIM66是否通過TGF-β/Smad信號通路影響細胞的惡性行為以及具體的作用機制目前尚不清楚。本研究的目的是探索TRIM66促進肺癌增殖與侵襲以及介導化療耐藥的相關機制，同時揭示TRIM66通過TGF-β/

4、Smad/EMT信號通路調(diào)控非小細胞肺癌的惡性生物學行為。
　　研究方法:1、樣本來源:本次研究獲得了中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會的批準。非小細胞肺癌組織以及相應癌旁正常組織取自于在該醫(yī)院確診為非小細胞肺癌并且進行手術切除的患者。臨床和組織病理學的數(shù)據(jù)，包括組織病理學診斷以及腫瘤分級均取自患者的醫(yī)療記錄?；颊咴谛g前未經(jīng)過化療和放療。2、免疫組織化學:腫瘤組織樣本用10％中性福爾馬林進行固定并用石蠟進行包埋，制備4μ m厚度的

5、樣本。樣本用二甲苯進行脫蠟，然后用濃度梯度的酒精進行再水化。接著使用檸檬酸鹽緩沖液進行抗原修復。使用雙氧水進行內(nèi)源性過氧化物酶的阻斷。使用山羊血清減少非特異性連接。進行一抗孵育，使用的抗體為TRIM66(mouse monoclonal antibody，1∶200 dilution)，孵育條件為4℃，過夜。鼠免疫球蛋白作為陰性對照。接著進行二抗孵育及DAB顯色，復染使用蘇木精染色液，封片前用濃度梯度酒精進行脫水。兩位病理專家對所有樣本

6、進行隨機檢測，每個樣本隨機選取5個視野，每個視野在放大400倍條件下均可觀察到100個細胞。TRIM66的免疫組織化學染色采用半定量法進行估測，包括腫瘤區(qū)域強度以及腫瘤細胞的百分比。TRIM66染色強度分為0(negative)，1(weak)，2(moderate)，3(strong)。按腫瘤細胞染色百分比分為1(1-25％)，2(26-50％)，3(51-75％)，4(76-100％)。樣本的最后評分為染色強度與腫瘤細胞百分比得分的

7、乘積，范圍在0-12之間。評分小于6為TRIM66低表達，大于等于6為TRIM66高表達。3、細胞培養(yǎng)與轉染:肺癌細胞系A549，H1299購買于美國典型培養(yǎng)物保藏中心。細胞培養(yǎng)用含10％胎牛血清，100IU/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為37℃，CO2濃度為5％。細胞接種密度都為1∶2，生長2-3d即可傳代一次。TRIM66質(zhì)粒購自origene公司，TRIM66干擾購自Dharmacon公司

8、。將細胞采用常規(guī)方法進行適當消化，均勻接種于6孔培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞生長成為單層70％密度時進行轉染。先用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)2小時對細胞進行饑餓處理。用Lipofectamine2000進行轉染。轉染步驟按照轉染試劑說明進行。轉染48小時收集細胞進行后續(xù)實驗。4、Western blot:細胞總蛋白的提取用RIPA裂解液，定量方法參照Bradford法。蛋白樣品轉印于PVDF膜上，并進行一抗孵育。一抗使用的抗體為TRIM66(1∶1

9、000)，p-Smad2(1∶1000), snail(1∶1000), slug(1∶1000), E-cadherin(1∶1000), N-cadherin(1∶1000),ZO-1(1∶1000)，GAPDH(1∶2000)，抗體孵育的條件為4 ℃，過夜。二抗孵育所用抗體為過氧化物酶耦合的山羊抗兔/鼠抗體(1∶2000)，孵育條件為37℃，兩小時。本實驗用.ECL發(fā)光液進行發(fā)光，使用DNR Imaging System進行曝光。

10、5、集落形成實驗:細胞經(jīng)過轉染或者干擾后48小時，收集細胞并接種于直徑為6cm細胞培養(yǎng)皿，接種密度約為1000個/皿。細胞連續(xù)培養(yǎng)7周，用PBS緩沖液漂洗細胞表面，并用吉薩姆染色液進行染色。在光學顯微鏡下進行觀察，超過50個細胞的集落即可進行計數(shù)。6、MTT實驗:細胞經(jīng)過轉染或者干擾后24小時，收集細胞并接種于96孔培養(yǎng)板中，接種密度約為每孔3000個細胞，連續(xù)培養(yǎng)5天。檢測細胞活力時，每孔加入20μl5 mg/ml MTT溶液，并繼續(xù)

11、在37℃條件下培養(yǎng)4小時。將培養(yǎng)基去除，每孔加入150μl DMSO。用酶標儀進行檢測，檢測波長為490nm。7、流式細胞術:細胞的凋亡水平通過AnnexinⅤ/PI雙染實驗進行分析，所用儀器為FACS Calibur流式細胞分析儀。細胞的周期變化情況通過PI單染實驗進行分析，所用儀器為FACS Calibur流式細胞分析儀。8、基質(zhì)膠侵襲實驗:細胞侵襲實驗用24孔Transwell小室，每個小室用20μ l基質(zhì)膠進行包被（基質(zhì)膠稀釋比

12、例為1∶3）。細胞轉染后48小時，用胰蛋白酶進行消化，并用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基進行稀釋。將稀釋后的細胞懸液加入到transwell上室中，下室加入含15％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃條件下培養(yǎng)16小時。將未闖過基質(zhì)膠的細胞用棉簽輕輕擦去，將穿過基質(zhì)膠的細胞用4％多聚甲醛進行固定，用蘇木精進行染色。隨機選取5個視野并在顯微鏡下進行計數(shù)。本實驗重復三次。9、統(tǒng)計分析:統(tǒng)計分析所用軟件為SPSS16.0。分析TRIM

13、66表達水平與臨床病理因素之間的相關性用卡方檢驗法。分析胃癌患者的生存概率用Kaplan-Meier檢驗法。分析不同組別患者生存率的差異采用Mantel' slog-rank檢驗法。Cox回歸模型應用于多變量分析。實驗組與對照組之間的差異采用Student's t檢驗法。p＜0.05表示具有顯著差異。
　　結果:1、TRIM66在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義。通過免疫組織化學方法檢測了非小細胞肺癌以及相應癌旁正常組織中TRIM6

14、6的表達水平，發(fā)現(xiàn)TRIM66在非小細胞肺癌組織中表達量顯著增加，而在癌旁正常組織中表達量較低。進一步分析TRIM66表達水平與臨床病理因素之間的相關性發(fā)現(xiàn)，TRIM66高表達與腫瘤惡性分化程度正相關(p=0.0283)。另外，TRIM66高表達與肺癌患者的p-TNM分期(p=0.0002)和淋巴結轉移(p=0.0133)有著顯著關系。進一步分析TRIM66與生存時間的關系，我們發(fā)現(xiàn)TRIM66高表達患者生存時間明顯小于TRIM66低表

15、達的患者的生存時間(p＜0.05)。COX多因素分析發(fā)現(xiàn)TRIM66高表達與淋巴結轉移是肺癌獨立的預后因素。2、TRIM66促進非小細胞肺癌增殖、侵襲，并增加腫瘤細胞的耐藥性。我們將TRIM66質(zhì)粒和siRNA分別轉染于A549，H1299兩株肺癌細胞系，并將處理后的細胞進行MTT實驗，集落形成實驗，細胞周期分析實驗，基質(zhì)膠侵襲實驗以分析TRIM66對細胞增殖，周期，侵襲產(chǎn)生的影響。MTT實驗結果表明轉染TRIM66后肺癌細胞的增殖能力

16、升高，而TRIM66特異性siRNA干擾明顯降低了肺癌細胞的增殖能力。集落形成實驗取得了相似的結果，TRIM66轉染后肺癌細胞形成的集落數(shù)目增加，而TRIM66特異性siRNA干擾明顯降低肺癌細胞形成的集落數(shù)目。Transwell實驗結果表明:TRIM66干擾后細胞的侵襲能力受到抑制而TRIM66質(zhì)粒轉染則促進了細胞的侵襲能力。將經(jīng)過TRIM66轉染以及干擾的肺癌細胞用順鉑進行處理，并通過流式細胞術分析其凋亡水平變化，結果表明:與對照組

17、相比，轉染TRIM66質(zhì)粒后，由順鉑誘導的凋亡率明顯降低;而干擾TRIM66后，由順鉑誘導的凋亡率明顯增加。3、TRIM66通過TGF-β/Smad2/EMT級聯(lián)信號通路調(diào)控非小細胞肺癌的惡性生物學行為。我們通過Western blot以及免疫熒光方法檢測與細胞增殖，侵襲相關蛋白的表達水平，發(fā)現(xiàn)轉染TRIM66后，肺癌細胞中p-Smad2，snail，slug，N-cadherin表達量上調(diào)，E-cadherin和ZO-1表達量下調(diào)。相

18、反干擾TRIM66后，肺癌細胞中p-Smad2，snail，slug，N-cadherin表達量下調(diào)，E-cadherin和ZO-1表達量上調(diào)。另外，我們研究發(fā)現(xiàn)TRIM66能夠調(diào)節(jié)Smad2的磷酸化水平（圖3）。TRIM66表達增加，p-Smad2升高;TRIM66表達下降，p-Smad2表達降低。接下來，我們應用TGF-β抑制劑來驗證TRIM66促進肺癌細胞發(fā)生EMT是否依賴于TGF-β/smad通路。在沉默了TRIM66的H129

19、9細胞中加入TGF-β抑制劑SB431542，濃度為10μM，作用時間為10小時，結果顯示，抑制TGF-β/smad通路能夠減弱TRIM66引起的EMT改變，提示TRIM66可能依賴TGF-β/smad通路促進肺癌細胞中的上皮間質(zhì)轉化。
　　結論:本研究證實了TRIM66在非小細胞肺癌中表達增加并與腫瘤較高的TNM分期，淋巴結轉移以及患者的不良預后情況顯著正相關。此外，還證實了TRIM66作為原癌基因在肺癌細胞系中促進細胞增殖，侵