中華補血草遺傳體系的優(yōu)化及轉(zhuǎn)錄組分析.pdf

1、土壤鹽漬化是全世界都面臨著的嚴重影響農(nóng)作物產(chǎn)量的難題,土壤中存在過多的鹽分對植物的生長有很多不利的影響,主要體現(xiàn)在滲透脅迫造成的離子毒害,抑制植物的生長,造成光合速率下降、植株衰老加速,甚至于造成植物死亡.重度的脅迫會對植物的生長發(fā)育造成嚴重的傷害,對植物完成其生命史有很大影響;導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量、質(zhì)量的下降,對農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)造成損失.
　　中華補血草(Limonium sinense)為藍雪科補血草屬(Limonium)多年生草本植物.

2、它是一種泌鹽鹽生植物,可將外界生境中的鹽離子吸收到體內(nèi)然后通過鹽腺將過量的鹽離子排到體外,對鹽分脅迫的耐受力比一般植物有很大的提高,在鹽漬化的土壤中也能很好地生長.目前,對補血草泌鹽過程的認識還停留在生理層面,但是對其泌鹽的分子機理的了解還很不清楚,抗鹽的關(guān)鍵因子仍需要繼續(xù)探索.以基因敲除技術(shù)為代表的強力的基因工程技術(shù),都需要有中華補血草的穩(wěn)定的、高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系.
　　本文是在已建立的中華補血草轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化,采用

3、了GUS和GFP作為報告基因使轉(zhuǎn)化體系在檢測的時候更加方便、直觀、分辨率更高,同時對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的中華補血草葉圓盤轉(zhuǎn)化體系中各相關(guān)環(huán)節(jié)進行進一步的比較和研究:
　　1)轉(zhuǎn)化了GUS、GFP的質(zhì)粒分別是潮霉素和除草劑抗性的,本實驗首先確定了中華補血草的葉片對這兩種篩選劑的敏感濃度.在補血草葉片的轉(zhuǎn)化受體篩選的環(huán)節(jié)中,確定了補血草對潮霉素和Basta的敏感濃度分別為20mg/L和2mg/L.
　　2)用不同的農(nóng)桿菌菌株侵染中華補血

4、草葉片外植體時,AGL-1菌株的侵染力高于其他三種菌株,補血草的愈傷和芽的分化率為45％,略高于EHA105,并遠遠高于LBA4404和GV3101菌株.
　　4)用重懸的轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌菌液浸染中華補血草外植體時,重懸菌液濃度在OD600=1.0時,效果最顯著,轉(zhuǎn)化率可達24％.
　　5)共培養(yǎng)天數(shù)的處理對中華補血草轉(zhuǎn)化率的也有一定的影響:3-4天的效率明顯高于只共培養(yǎng)1-2天.其中以3d的共培養(yǎng)效果最好,更長的時間不僅不會

5、帶來轉(zhuǎn)化效率的提高,反而會由于農(nóng)桿菌過量生長的幾率加大,使外植體受到損害,降低了效率.
　　6)預(yù)培養(yǎng)的天數(shù):0天沒經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的外植體死亡率太高;1天的效率略有升高低于2天的;2天以上的效率沒有明顯的提高,隨著時間的延長會長出愈傷,侵染后的嵌合體出現(xiàn)率大大增加.這說明預(yù)培養(yǎng)2天最為合適.
　　本文對轉(zhuǎn)化的再生苗進行了PCR擴增檢測,獲得了抗性植株,但GFP熒光表達不明顯,GUS染色效果亦不明顯.說明質(zhì)粒攜帶的報告基因在補血草