默克爾細胞局部注射聯(lián)合MEBO外用對大鼠足底創(chuàng)面神經(jīng)再生的實驗研究.pdf

1、目的：
　　通過對SD大鼠默克爾細胞（merkel cell，MCs）的提取、分離、培養(yǎng)及鑒定，觀察局部注射MCs聯(lián)合美寶濕潤燒傷膏（MEBO）外用對大鼠足底創(chuàng)面神經(jīng)再生的影響。
　　方法：
　　1)取新生SD大鼠（1～3d）足墊、須墊及背部皮膚，采用酶消化法分離提取MCs,接種于多聚賴氨酸（PLL）包被的培養(yǎng)瓶內(nèi)，通過細胞免疫組織化學(xué)法測定細胞角蛋白CK20的表達，qPCR檢測MCs中Piezo2 mRNA的表達，E

2、LISA法檢測培養(yǎng)第2d、4d、6d、8d、10d細胞分泌CGRP情況。
　　2)建立SD大鼠足底創(chuàng)面模型，按照干預(yù)方式的不同分為如下五組：A組（MCs注射+MEBO組）；B組（MCs局部注射組）；C組（MEBO外用組）；D組（陰性對照組）；E組（鼠神經(jīng)生長因子注射陽性對照組）。細胞組用MCs1×106個/mL分別注射于創(chuàng)面基底中央及創(chuàng)緣3、6、9、12點標記處，24小時后追加1次，每次每個部位25μL；MEBO組按相應(yīng)分組給予M

3、EBO外用，每日換藥一次，直至創(chuàng)面愈合。陽性及空白對照組分別予等體積鼠神經(jīng)生長因子及PBS注射。觀察創(chuàng)面愈合時間，計算各組創(chuàng)面各時間點愈合率，棉拭子檢測足底感覺恢復(fù)情況，分別于干預(yù)后7d、14d、21d三個時相各組分別隨機抽取6只大鼠，切取組織，制作石蠟切片，免疫熒光染色觀察新生皮膚神經(jīng)纖維生長情況。
　　3）每組大鼠均于造模后第7d、14d、21d時用棉拭子檢測大鼠足底縮足反射，記錄、統(tǒng)計縮足次數(shù)并計算百分比。
　　結(jié)果：

4、
　　1）采用中性蛋白酶和胰酶依次消化SD大鼠足底及須墊部位所取皮膚組織可得到較多MCs，以CK20做細胞免疫化學(xué)染色可見MCs呈陽性反應(yīng)。
　　2）實驗中應(yīng)用中性蛋白酶及胰酶雙酶消化法可得到MCs，以Ham,s F-12培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入20ng/ml bFGF可使MCs穩(wěn)定增殖；qPCR結(jié)果示MCs中Piezo2 mRNA的表達量為：0.0270±0.0042；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法檢測檢測MCs上清液

5、中降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP)在培養(yǎng)第2、4、6、8、10天濃度隨培養(yǎng)時間的延長逐漸增加，培養(yǎng)第6d到8d時增加速率更快，間接提示默克爾細胞增殖情況。
　　3）創(chuàng)面愈合方面，大體觀察腫脹程度及炎性反應(yīng)程度無明顯區(qū)別，總愈合時間上應(yīng)用MEBO的兩組創(chuàng)面較其他實驗組提前，A組～E組愈合時間分別為14.33±0.69天、16.44±0.86天、14.83±0.71天、17.44±0.98天、16.27±0.67天。在同時間點創(chuàng)面愈合率上

6、，A組和C組優(yōu)于其他對照組（P＜0.05），到21d時各組創(chuàng)面均全部愈合。在縮足反射比較上，除E組外，A組較其他三組反射閾值更低、對刺激更敏感(P＜0.05)，提示默克爾細胞聯(lián)合MEBO應(yīng)用有促進大鼠足底創(chuàng)面神經(jīng)再生的作用。
　　4）創(chuàng)面新生皮膚免疫熒光染色顯示示A組在神經(jīng)纖維數(shù)量較多、排列有序，優(yōu)于陰性對照或單一實驗處理組，與陽性對照組（E組）相近。
　　結(jié)論：
　　1）中性蛋白酶及胰酶雙酶消化法是獲取大鼠MCs的有