門多薩假單胞菌NK-01生物合成褐藻寡糖和PHAMCL及其代謝途徑改造.pdf

1、本研究以門多薩假單胞菌NK-01(Pseudomonas mendocina NK-01)為菌種，研究了其利用非相關(guān)性碳源如：葡萄糖，發(fā)酵生產(chǎn)中長(zhǎng)鏈聚羥基脂肪酸酯(Medium-chain-length polyhydroxyalkanoates，PHAMCL)和褐藻寡糖(AlginateOligosaccharides，AO)。同時(shí)，對(duì)雙產(chǎn)物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定和物理性能表征。其次，利用基因敲除技術(shù)阻斷PHAMCL的合成途徑，使得褐藻寡糖的

2、產(chǎn)量增加，對(duì)雙產(chǎn)物的代謝競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系進(jìn)行了探討。最后，對(duì)PHA合成酶PhaC1和PhaC2的底物特異性進(jìn)行了研究。
　　 200 L發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明，P.mendocina NK-01經(jīng)過(guò)48 h的發(fā)酵，最終能夠積累0.316 gL-1PHAMCL和0.57 g-1AO。P.mendocina NK-01是第一株能夠利用葡萄糖直接合成AO的微生物。通過(guò)1H、13C核磁共振(NMR)、傅里葉紅外光譜分析(FT-IR)、氣相色譜.質(zhì)譜聯(lián)用(

3、GC-Mass)以及凝膠滲透色譜(GPC)等分析手段對(duì)合成的AO和PHAMCL進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明，褐藻寡糖主要由β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronic acid，M)和α-L-古洛糖醛酸(α-L-guluronic acid，G)這兩種單體組成。并且在單體的C-2或者C-3有部分乙酰化。GPC測(cè)定結(jié)果表明，AO主要由兩個(gè)組份所組成，重均分子量分別為1546和1029 Da。而對(duì)PHAMCL的分析表明，它主要的組成單體是3-

4、羥基辛酸(3-hydroxyoctanoate，3HO)和3-羥基癸酸(3-hydroxydecanoate，3-HD)，而另外五種單體3-羥基己酸(3-hydroxyhexanoate，3-HHx)、3-羥基十二烷酸(3-hydroxydodecanoate，3-HDD)、3-羥基十四烷酸(3-hydroxytridecanoate，3-HTD)、3-羥基十六烷酸(3-hydroxyhexadecanoate，3-HHD)以及3-羥基

5、十八烷酸(3-hydroxyoctadecanoate，3-HOD)只占組成單體的很小比例。通過(guò)示差掃描量熱法分析(DSC)表明，PHAMCL的熔融溫度(Tm)和玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Ta)分別為51.03℃和-41.21℃。熱重分析(TG)表明，PHAMCL的熱分解溫度(Td)約為300℃。因此，該P(yáng)HA的溫度加工范圍很寬。拉伸力學(xué)(Tensile Testing)試驗(yàn)表明在12 MPa壓力下PHAMCL的斷裂伸長(zhǎng)率為700％，是一種粘彈性

6、的高分子材料。X射線衍射分析(XRD)表明，PHAMCL具有很低的結(jié)晶度。
　　 由于P.mendocina NK-01能夠同時(shí)合成PHAMCL和AO，推測(cè)若阻斷PHAMCL的合成途徑，是否能夠使得AO的產(chǎn)量得到增加。利用PCR技術(shù)對(duì)P.mendocinaNK-01 PHAMCL合酶基因操縱子進(jìn)行克隆，該合酶屬于二型PHA合成酶，整個(gè)操縱子大小為4.5 kb，兩個(gè)合酶基因大小均為1.7 kb，中間被一個(gè)大小為0.85 kb的降解

7、酶基因分隔開。將這三個(gè)開放閱讀框序列分別提交至GenBank，分別獲得登錄號(hào)：phaC1(DQ316602.1)、phaZ(HM585027.1)phaC2(EU580408.1)。利用自殺質(zhì)粒pEX18Tc對(duì)NK-01合成酶操縱子進(jìn)行敲除，大約57％的操縱子基因被敲除掉，獲得突變體P.mendocina C7。通過(guò)PCR和抗性實(shí)驗(yàn)對(duì)突變體Pmendocina C7進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，P.mendocina C7是PHA合成酶敲除突變體

8、。搖瓶和30 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)過(guò)48 h發(fā)酵，突變體P.mendocina C7合成AO的產(chǎn)量分別是野生菌的2.21倍和2.64倍，且在突變體中檢測(cè)不到PHAMCL的合成。利用MS和GPC對(duì)突變體合成的AO的品質(zhì)分析表明，它所合成的產(chǎn)物在單體組成和分子量方面與野生菌是一致的。以上實(shí)驗(yàn)表明，在P.mendocina NK-01中，AO和PHAMCL具有代謝上的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。此前，只有文獻(xiàn)報(bào)道在銅綠假單胞菌中，PHAMCL的合成和褐藻多糖的

9、合成具有代謝上的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，而我們的實(shí)驗(yàn)表明AO和PHAMCL具有代謝上的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。由此，我們推測(cè)在P.mendocinaNK-01的胞外能夠分泌褐藻多糖降解酶，將合成的褐藻多糖降解為AO。
　　 由于獲得AO的高效生產(chǎn)菌需要敲除PHA合成酶操縱子，因此獲得的突變株是PHA合成缺陷株，可以用于PHA合成酶基因phaC1和phaC2的功能研究。P.mendocina NK-01合成的PHA單體以3HO和3HD為主，因此闡明是野生菌中

10、PhaC1和PhaC2中的哪個(gè)合成酶在對(duì)PHA的合成起主要作用，闡明PhaC1和PhaC2的底物偏好性，從而可控地合成一些不同單體組成和含量的PHAMCL將具有重要意義。我們將phaC1和phaC2分別克隆到表達(dá)載體pBBR1MCS-2構(gòu)建pBBR1MCS-C1和pBBR1MCS-C2，并將這兩個(gè)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化PHAMCL合成缺陷株P(guān).mendocina C7。分別將得到的兩株基因工程菌命名為P.mendocina C7C1相P.mend

11、ocina C7C2。對(duì)它們進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)并提取PHA，從而對(duì)PhaC1和PhaC2合成PHA的產(chǎn)率進(jìn)行比較，同時(shí)對(duì)所合成的PHA的單體組成、分子量及物性等方面進(jìn)行表征。表征時(shí)所使用的手段有GC/MS、GPC、DSC、TGA和XRD。結(jié)果表明，PhaC1的活性比PhaC2更高以致于可以合成更多的PHAMCL，但是所合成的PHAMCL的分子量較低。GC/MS分析表明，PhaC1和PhaC2所合成的PHAMCL在單體組成方面具有極高的相似