草原龍膽C類MADS-box基因克隆與表達分析.pdf

1、草原龍膽(Eustoma grandiflorum)為龍膽科(Gentianaceae)龍膽屬(gentian)觀賞植物,原產(chǎn)于美國中南部,因其適應(yīng)性強、花姿典雅、花莖頎長、花色豐富艷麗而成為國際流行的鮮切花。草原龍膽既具有單瓣花又有重瓣花,重瓣花的四輪花器官發(fā)育正常且雄蕊數(shù)目穩(wěn)定,這與重瓣花多存在雄蕊瓣化的現(xiàn)象不同。為了闡釋草原龍膽花器官發(fā)育的分子機理,探討花器官特征MADS-box基因的保守性及表達情況,本研究以草原龍膽黃色單瓣(4

2、9號)及重瓣花(50號)品系為實驗材料,通過RACE技術(shù)克隆AG-like亞家族MADS-box基因并開展氨基酸序列分析、系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建和基因空間表達特異性分析等實驗工作,為深入研究草原龍膽花發(fā)育的分子機理奠定堅實的基礎(chǔ)。
　　 (1)以草原龍膽作為實驗材料,利用cDNA末端快速擴增技術(shù),根據(jù)已知的基因3’端序列設(shè)計基因特異引物并克隆基因5’端序列。利用RT-PCR方法克隆獲得3條C類MADS-box基因全長cDNA序列,為分析

3、基因進化和表達情況奠定基礎(chǔ)。
　　 (2)為探究這些基因與已公布的C類基因之間的同源性,將它們的核苷酸及氨基酸序列進行比對以確定其相似性和特殊基序。EgPLE1,EgPLE2和EgPLE3的蛋白質(zhì)序列和AG及PLE有高度的相似性。多序列比對顯示EgPLE1,EgPLE2和EgPLE3都具有MIKC型蛋白質(zhì)特有的結(jié)構(gòu)域和AG基序,其中AG基序是AG亞家族基因C結(jié)構(gòu)域所特有的。系統(tǒng)進化分析顯示這三個基因與核心真雙子葉植物的C類MAD

4、S-box基因有較近的親緣關(guān)系,說明它們是AG或者PLE的直系同源基因?；蚪MDNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后,用EgPLE1,EgPLE2和EgPLE3的特異探針進行雜交實驗。結(jié)果顯示EgPLE1在基因組中至少存在兩個拷貝。
　　 (3)為檢測EgPLE1,EgPLE2和EgPLE3在草原龍膽單重瓣品系中的空間表達特異性,分別以營養(yǎng)和生殖器官的RNA為模板進行RT-PCR。實驗結(jié)果顯示草原龍膽C類MADS-box基因EgPLE1、E