越南篦齒蘇鐵(Cycas elongata)MADS-box基因克隆表達(dá)模式分析與內(nèi)參基因篩選.pdf

1、MADS-box基因是真核生物中一類編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的基因家族，在植物花器官發(fā)育中起重要的調(diào)控作用，在過去二十多年中相關(guān)研究已取得較大進(jìn)展，如著名的花發(fā)育ABCE模型，但關(guān)于花的起源卻是未解之謎。裸子植物作為被子植物親緣關(guān)系最近的類群，將成為研究花起源分子機(jī)制的重要切入點(diǎn)。裸子植物MADS-box基因的研究多集中在銀杏、松柏類與買麻藤類中，蘇鐵類的相關(guān)研究卻比較缺乏，因此我們利用越南篦齒蘇鐵（Cycas elongata）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘

2、獲得12條MADS-box相似序列，并在8種不同組織中對(duì)12個(gè)基因進(jìn)行空間表達(dá)模式的分析。獲得的12條MADS-box基因，其中2條屬于I型基因，10條屬于MIKCC型基因。通過系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建將基因歸到10個(gè)基因亞族中：AG、GGM13（Bsister）、AGL6、TM8、GGM4、GpMADS4、TM3、SVP、GGM19、GGM7和I型（Mβ+Mγ）。Type I型基因CeMADS11、12在營養(yǎng)器官與生殖器官中均有表達(dá)。MIKCC

3、型基因中，CeMADS1、3、4三個(gè)基因在生殖器官中特異表達(dá)，CeMADS2以及CeMADS5-10共七個(gè)基因在生殖器官與營養(yǎng)器官中都有表達(dá)。除了GpMADS4亞族為裸子植物特有亞類外，其他亞族MADS-box基因的功能在種子植物進(jìn)化過程中都相對(duì)保守。特別是花發(fā)育相關(guān)的B、C和E（AGL6-like）型同源基因，至少在3億年前就已經(jīng)存在于裸子植物與被子植物的共同祖先中，并且參與調(diào)控生殖器官的生長與發(fā)育。
　　熒光定量 PCR是研究

4、基因表達(dá)量的重要技術(shù)手段，具有靈敏度高、實(shí)時(shí)性強(qiáng)、準(zhǔn)確性上佳的特性，為了消除cDNA在合成過程中由于RNA本身純度、產(chǎn)量、完整性和擴(kuò)增酶效應(yīng)以及 PCR擴(kuò)增效率等因素帶來的誤差，需要選用穩(wěn)定的內(nèi)參基因?qū)δ繕?biāo)基因進(jìn)行相對(duì)定量分析?；诒狙芯繉?duì)MADS-box基因表達(dá)模式分析的需求，并且現(xiàn)在并無蘇鐵類內(nèi)參基因相關(guān)報(bào)道的事實(shí)，本研究利用越南篦齒蘇鐵轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，挖掘并鑒定了13個(gè)內(nèi)參基因（ACT7、TUB、UBQ、EIF4、EF1、CLATHR

5、IN1、PP2A、RPB2、GAPC2、TIP41、MAPK、SAMDC和 CYP），在越南篦齒蘇鐵8種不同組織器官中進(jìn)行qRT-PCR，并使用NormFinder、GeNorm和 BestKeeper三個(gè)軟件進(jìn)行內(nèi)參基因穩(wěn)定性評(píng)估，最后獲得最穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)镚PAC2和RPB2，最不穩(wěn)定的內(nèi)參基因是ACT7。
　　據(jù)我們所知，這是首次在越南篦齒蘇鐵中克隆得到多個(gè)MADS-box基因并進(jìn)行表達(dá)模式的分析，對(duì)裸子植物中蘇鐵類MADS