“痰瘀同治”方藥調(diào)控肥大細(xì)胞功能改善動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:動(dòng)脈粥樣硬化(AS)導(dǎo)致的心腦血管疾病是當(dāng)今人類死亡的首位原因，其重要的特征之一就是病灶處各類炎癥、免疫細(xì)胞的聚集浸潤(rùn)。肥大細(xì)胞作為機(jī)體分泌最活躍的細(xì)胞之一，主要通過(guò)脫顆粒、釋放顆粒內(nèi)容物產(chǎn)生多種活性介質(zhì)等發(fā)揮作用。有病理研究發(fā)現(xiàn)因心肌梗塞死亡的病人冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂處的血管外膜周邊存在著大量的肥大細(xì)胞，且大多呈被激活脫顆粒后狀態(tài)，這表明肥大細(xì)胞與斑塊的發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)。祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中醫(yī)對(duì)于AS發(fā)生機(jī)制的解釋歸結(jié)為“痰瘀

2、互結(jié)證”。AS初期病變脂質(zhì)條紋、內(nèi)膜下泡沫細(xì)胞集聚即為痰濁阻滯、痰凝不散之具體體現(xiàn);AS后期斑塊破裂，血小板激活以及高凝血狀態(tài)、血栓形成視為血瘀證范疇。我院吳宗貴教授主持研制的“痰瘀同治”方藥(Eliminating Sputum andRemoving Stasis Formulation)在前期研究中已經(jīng)證明具有改善新西蘭兔高脂血癥、調(diào)控小鼠T細(xì)胞免疫等作用。本試驗(yàn)?zāi)康氖墙柚鶤poE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型，探究“痰瘀同治”方

3、藥如何通過(guò)調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞功能改善斑塊的機(jī)制。
　　研究方法:
　　1、ApoE-/-小鼠AS斑塊模型的建立與評(píng)估:選用6-8周齡雄性ApoE-/-小鼠為研究對(duì)象。(1)建模:首先行小鼠左頸動(dòng)脈分支限流術(shù)，造成局部血液渦流狀態(tài);一周后行左腎動(dòng)脈狹窄術(shù)，引發(fā)腎血管性高血壓。術(shù)前和手術(shù)期間給予普通飲食喂養(yǎng)，左腎動(dòng)脈狹窄術(shù)后第2天開(kāi)始給予高脂飼料喂養(yǎng)直至第12周實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。(2)模型效果評(píng)估:建模第4周對(duì)小鼠進(jìn)行頸動(dòng)脈插管測(cè)量動(dòng)脈收縮壓

4、及小動(dòng)物血流多普勒超聲檢測(cè)頸動(dòng)脈血流峰速情況，試驗(yàn)終點(diǎn)比較頸動(dòng)脈斑塊負(fù)荷程度三個(gè)方面來(lái)評(píng)估小鼠AS斑塊模型制備情況。
　　2、“痰瘀同治”方藥調(diào)控肥大細(xì)胞功能改善動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的機(jī)制研究:將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(CON)、單純模型組(MOD)、阿托伐他汀組(ATO)、“痰瘀同治”方藥組（ERF），每組10只。飼以高脂飼料喂養(yǎng)同時(shí)灌胃給藥，12周實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)采用主動(dòng)脈內(nèi)膜大體油紅o染色比較斑塊面積;主動(dòng)脈根部冰凍切片油紅染色比較斑塊

5、內(nèi)脂質(zhì)負(fù)荷面積;膽固醇及甘油三酯液體單試劑檢測(cè)盒（酶法）檢測(cè)總膽固醇(TC)、總甘油三酯(TG)水平;快速蛋白液相色譜法(FPLC)檢測(cè)小鼠血漿脂蛋白含量;比色法測(cè)定血清類胰蛋白酶活性;主動(dòng)脈根部冰凍切片甲苯胺藍(lán)染色比較血管外膜周邊肥大細(xì)胞聚集脫顆粒情況;熒光實(shí)時(shí)定量PCR(PolymeraseChain Reaction)和免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Westem blot)測(cè)定肥大細(xì)胞相關(guān)蛋白和血漿炎癥因子表達(dá)情況。
　　研究結(jié)果:

6、　　1、ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型的測(cè)評(píng)
　　(1)小鼠頸動(dòng)脈插管測(cè)量動(dòng)脈收縮壓:ApoE-/-小鼠采用頸動(dòng)脈插管法檢測(cè)動(dòng)脈收縮壓，測(cè)得對(duì)照小鼠收縮壓平均為108.9±9.8mmHg，其余模型小鼠收縮壓平均為154.5±9.1 mmHg，模型小鼠之間收縮壓差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(2)小鼠頸動(dòng)脈多普勒超聲測(cè)量血流峰值:同對(duì)照組（627.52±44.82 mm/s）相比較，結(jié)扎后4周（205.72±36.84 mm

7、/s）模型小鼠左頸動(dòng)脈血液流速收縮期峰值(peak systolic velocity，Vmax)明顯下降。模型小鼠之間頸動(dòng)脈血液流速收縮期峰值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(3)小鼠頸動(dòng)脈冰凍切片蘇木精依紅染色(HE)及油紅o染色:較對(duì)照組(539.32±58.92×103um2)，模型組小鼠（790.59±92.12×103um2）頸動(dòng)脈切片斑塊負(fù)荷面積明顯增加。以上結(jié)果提示，局部頸動(dòng)脈低切應(yīng)力(LSS)及腎血管性高血壓誘導(dǎo)可加速小

8、鼠動(dòng)脈粥樣硬化的形成及發(fā)展。
　　2、“痰瘀同治”方藥調(diào)控肥大細(xì)胞功能改善動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的機(jī)制研究:“痰瘀同治”方組較阿托伐他汀組降低小鼠血漿TC水平效果更為明顯，其血漿TG、血漿低密度脂蛋白（LDL）、血清類胰蛋白酶含量較模型組亦顯著下降。主動(dòng)脈血管組織肥大細(xì)胞相關(guān)蛋白:白三烯C4合成酶(LTC4S)、組氨酸脫羧酶(HDC)、類糜蛋白酶1(CMA1)、類胰蛋白酶6（MCT6）與血漿腫瘤壞死因子（TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(

9、TGF-β1)在阿托伐他汀組和“痰瘀同治”方組之間存在顯著差異。主動(dòng)脈內(nèi)膜大體油紅o染色和主動(dòng)脈根部冰凍切片油紅o及甲苯胺藍(lán)染色顯示模型可加速動(dòng)脈硬化粥樣斑塊形成，促使肥大細(xì)胞在動(dòng)脈血管外膜聚集脫顆粒，“痰瘀同治”方藥可減少動(dòng)脈血管內(nèi)斑塊負(fù)荷面積，降低斑塊內(nèi)脂質(zhì)負(fù)荷水平，削弱肥大細(xì)胞在動(dòng)脈外膜處的聚集和脫顆粒程度，從而達(dá)到改善動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的作用。
　　研究結(jié)論:
　　1、ApoE-/-小鼠頸動(dòng)脈分支限流合并腎動(dòng)脈狹窄手術(shù)