AQP4極性表達(dá)變化對(duì)出血性腦水腫發(fā)生發(fā)展的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、腦出血（intracerebral hemorrhage, ICH）是臨床上中老年人的常見病、多發(fā)病，具有高死亡率和高致殘率的特點(diǎn)。腦水腫是腦出血最重要的并發(fā)癥之一，其發(fā)生發(fā)展直接關(guān)系到患者的預(yù)后，因此腦水腫的形成機(jī)制一直是神經(jīng)科學(xué)研究的重點(diǎn)內(nèi)容。腦水腫發(fā)生的關(guān)鍵是腦細(xì)胞內(nèi)、外水電解質(zhì)分布失衡，從而破壞了腦細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)的完整性。水通道蛋白家族（aquaporins, AQPs）的發(fā)現(xiàn)，為進(jìn)一步闡明腦內(nèi)水電解質(zhì)運(yùn)輸平衡及其異常的

2、分子機(jī)制提供了新契機(jī)。
　　AQPs是一類介導(dǎo)水分子高速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的細(xì)胞膜通透蛋白，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)水電解質(zhì)平衡中發(fā)揮了重要作用。水通道蛋白4（aquaporin4，AQP4）是目前發(fā)現(xiàn)的腦內(nèi)表達(dá)最豐富的水通道蛋白。生理情況下， AQP4密集表達(dá)在腦實(shí)質(zhì)與腦脊液/血液交界處的星形膠質(zhì)細(xì)胞終足膜上，參與構(gòu)成膠質(zhì)界膜，其在維持腦內(nèi)動(dòng)態(tài)水平衡中發(fā)揮了重要作用。研究者們將 AQP4在星形膠質(zhì)細(xì)胞終足膜上密集表達(dá)的這一分布模式稱之為AQP4的

3、“極性表達(dá)”（polarized expression）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞終足膜上的AQP4以正交序列（orthogonal arrays of particles, OAPs）的形式存在，OAPs是AQP4行使其高效水轉(zhuǎn)運(yùn)功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。生理?xiàng)l件下，AQP4極性表達(dá)在與水轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)的星形膠質(zhì)細(xì)胞終足膜上，對(duì)維持血腦/血腦脊液間水電解質(zhì)平衡具有至關(guān)重要的作用；而在病理情況下，AQP4極性表達(dá)障礙，OAPs的形成亦明顯降低，

4、AQP4的高效水轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙，引起血腦/血腦脊液間水平衡紊亂。
　　AQP4極性表達(dá)與肌萎縮蛋白-肌營(yíng)養(yǎng)不良聚糖蛋白復(fù)合物（dystrophin-dystroglycan complex，DDC）密切相關(guān)。DDC復(fù)合物是一組連接細(xì)胞外基質(zhì)分子與細(xì)胞骨架的相互作用蛋白，其成員包括Dystroglycan（DG），dystrobrevin和syntrophin，核心成員為DG（包括α-DG與β-DG）。β-DG是跨膜分子，在細(xì)胞外經(jīng)α

5、-DG與細(xì)胞外基質(zhì)連接，在細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞骨架連接，并通過α-syntrophin將AQP4極性錨定到星形膠質(zhì)細(xì)胞終足膜上。研究發(fā)現(xiàn)，DG基因敲除后，血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞終足膜上的AQP4極性表達(dá)缺失，提示其在AQP4極性定位中發(fā)揮了重要作用。
　　對(duì)于ICH這種常見病、多發(fā)病，目前的研究集中在ICH腦組織中AQP4表達(dá)量的變化上，而對(duì)AQP4極性表達(dá)是否變化，極性表達(dá)變化是否與出血性腦水腫相關(guān)，目前尚未見報(bào)導(dǎo)。為此，本課題擬應(yīng)用自體

6、血注入法建立ICH動(dòng)物模型，研究AQP4極性表達(dá)變化對(duì)出血性腦水腫發(fā)生發(fā)展的影響，以及研究AQP4的錨定蛋白β-DG對(duì)AQP4極性表達(dá)變化的影響，以期為腦水腫形成的分子機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)以及為腦水腫治療提供新思路。
　　目的:
　　1．研究AQP4在ICH腦組織中的表達(dá)變化，以及AQP4極性表達(dá)變化對(duì)出血性腦水腫發(fā)生發(fā)展的影響；
　　2．研究DDC復(fù)合物的核心成員β-DG與AQP4在ICH腦組織中的表達(dá)變化，以初步探

7、討β-DG對(duì)AQP4極性表達(dá)變化的影響。
　　方法:
　　健康成年雄性SD大鼠204只，隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組（sham組）與ICH組（ICH后1 d、3 d、7 d）。采用自體血注入法建立大鼠ICH動(dòng)物模型，應(yīng)用核磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）檢測(cè)血腫產(chǎn)生及發(fā)展，干濕重法檢測(cè)腦水含量變化，伊文斯蘭（Evans Blue, EB）注入法檢測(cè)血腦屏障（blood-brain barri

8、er, BBB）通透性改變，透射電鏡和 HE染色檢測(cè)組織病理結(jié)構(gòu)變化，免疫印跡和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血腫周圍組織中AQP4蛋白及其mRNA表達(dá)變化，免疫熒光雙標(biāo)記檢測(cè) AQP4的極性表達(dá)變化，免疫熒光雙標(biāo)記檢測(cè) AQP4與β-DG的共表達(dá)變化，免疫印跡和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)血腫周圍組織中β-DG蛋白及其 mRNA的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1．ICH腦組織中AQP4極性表達(dá)缺失
　　MRI檢測(cè)顯示所有模型組均有

9、明顯的邊界清楚的血腫，ICH后1 d的血腫直徑最大，表明50μl自體血注入大鼠尾狀核后，成功的建立了ICH動(dòng)物模型。ICH后1 d、3 d的腦水含量明顯增高，與sham組比較，差值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。ICH后1 d、3 d血腫周圍組織中的EB含量均明顯增高，與 sham組比較，差值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；HE染色和透射電鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)血腫周圍組織結(jié)構(gòu)破壞明顯，以ICH后1 d為甚，可見血管周圍間隙增寬，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞胞

10、漿腫脹，胞漿內(nèi)出現(xiàn)小泡、小囊等結(jié)構(gòu)。ICH后1 d，血腫周圍組織中，AQP4蛋白與mRNA含量均明顯增高，與sham組比較，差值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與sham比較，ICH后3 d、7 d的AQP4蛋白與mRNA含量均無明顯變化，差值不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。免疫熒光雙標(biāo)記結(jié)果顯示， sham組中，AQP4極性表達(dá)在軟腦膜下外膠質(zhì)界膜、室管膜細(xì)胞基底部及其下的內(nèi)膠質(zhì)界膜以及尾狀核毛細(xì)血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞終足膜上；而 I

11、CH組，AQP4成團(tuán)的聚集在外膠質(zhì)界膜、彌散性的表達(dá)在整個(gè)室管膜細(xì)胞，以及表達(dá)到血腫周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體和突起上，即ICH腦組織中，AQP4極性表達(dá)缺失。
　　2．β-DG表達(dá)下調(diào)與AQP4極性表達(dá)缺失密切相關(guān)
　　對(duì)照組中AQP4與β-DG共表達(dá)在軟腦膜下外膠質(zhì)界膜、室管膜細(xì)胞基底部及其下的內(nèi)膠質(zhì)界膜、腦實(shí)質(zhì)毛細(xì)血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞終足膜上；而ICH組，在血腫周圍組織、室管膜細(xì)胞及外膠質(zhì)界膜上的AQP4極性表達(dá)缺失，同時(shí)伴

12、隨著β-DG在上述部位的表達(dá)明顯降低，僅可見稀疏的、散在的位于星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體上的陽(yáng)性表達(dá)。而在穹窿下器官、視上核、海馬、齒狀回等 AQP4非極性表達(dá)部位，AQP4與β-DG仍然呈明顯的共表達(dá)。ICH后1 d、3d、7 d的血腫周圍組織中，β-DG蛋白含量明顯降低，與sham組比較，差值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。ICH后1 d、3 d、7 d的血腫周圍組織中，β-DG mRNA含量無明顯變化，與sham組比較，差值不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

13、（P>0.05）。
　　結(jié)論:
　　1．自體血注入后，ICH腦組織中存在水平衡紊亂，并且本模型所誘導(dǎo)的出血性腦水腫主要為血管源性腦水腫；
　　2．血腫周圍組織中AQP4表達(dá)增強(qiáng)，但其主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體上，而非極性表達(dá)到星形膠質(zhì)細(xì)胞終足膜上，即ICH后腦組織中，AQP4極性表達(dá)缺失；
　　3．ICH后腦組織中，伴隨著AQP4的極性表達(dá)缺失，β-DG表達(dá)下調(diào)，提示β-DG表達(dá)下調(diào)與AQP4極性表達(dá)缺失密切相關(guān)

14、；
　　4．AQP4極性表達(dá)缺失具有重要的病理生理意義。β-DG表達(dá)下調(diào)后，AQP4難于通過β-DG與細(xì)胞外基質(zhì)連接，從而不能極性定位到星形膠質(zhì)細(xì)胞終足膜上；血腫周圍組織中，由于血凝塊回縮血漿滲出，以及毛細(xì)血管通透性增加，血管內(nèi)容物滲出等原因，大量水分積聚到細(xì)胞外間隙，但此時(shí)血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞終足膜上的極性表達(dá)的AQP4明顯降低，不能及時(shí)有效的將細(xì)胞外間隙的水分快速轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)毛細(xì)血管，從而延緩了水腫的清除。即 AQP4極性表達(dá)缺失可