醛固酮對(duì)成年豚鼠心室肌細(xì)胞延遲整流鉀電流的影響.pdf_第1頁
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文檔簡(jiǎn)介

1、本研究目的就是主要利用電生理技術(shù)在高醛固酮整體動(dòng)物和體外培養(yǎng)細(xì)胞研究醛固酮對(duì)成年豚鼠心室肌細(xì)胞延遲整流K+電流IKr和IKs的影響,并分析其作用機(jī)制。
  第一部分 高醛固酮血癥對(duì)成年豚鼠心肌細(xì)胞延遲整流鉀電流的影響
  目的:觀察在體試驗(yàn)中高醛固酮血癥對(duì)成年豚鼠心肌細(xì)胞動(dòng)作電位、延遲整鉀電流的影響。
  方法:成年雄性豚鼠,200-250g,每組10只,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,2.5%三溴乙醇腹腔注射(225mg·kg-1)

2、麻醉下背部皮下植入滲透性微泵給予醛固酮泵入28天。醛固酮溶解在聚乙二醇400(PEG-400,釋放速度1μg·h-1)。對(duì)照組按相同方式植入微泵給予溶劑。各組豚鼠可以自由獲得含0.5% Na+的正常食物和水,同時(shí)被保持在一個(gè)恒定飼養(yǎng)環(huán)境中(傳統(tǒng)的12h/12h晝夜周期,6鋤開始)。
  給藥結(jié)束后,取豚鼠血液1.5-2 ml,測(cè)定血清K、Na離子濃度。之后取心臟,酶法急性分離豚鼠左室心肌細(xì)胞,利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),分別記錄動(dòng)作電位

3、、IKs、 IKr,觀察醛固酮對(duì)心肌動(dòng)作電位和延遲整流鉀電流IKs、IKr的影響。采用電壓鉗進(jìn)行刺激和記錄。膜片鉗技術(shù)V-clamp模式記錄細(xì)胞膜電流,微電極拋光后,灌充電極內(nèi)液,控制電阻值在1-3MΩ。電極內(nèi)液成分為(mM): KCl140,Mg-ATP4,MgCl21,EGTA5,and HEPES10(pH7.2 with KOH);電極外液分為(mM): NaCl132,KCl4,CaCl21.8,MgCl21.2,glucos

4、e5 and HEPES10(pH7.4 with NaOH)。鉗制電壓在-40mV,使Na通道和T-型Ca通道失活;電極外液中加入尼莫地平(Nim,1μm),阻斷L-型Ca通道;記錄IKs時(shí)加入2μM E4031,阻斷延遲整流鉀電流快激活成分IKr;記錄IKr時(shí)加入20μM chromanol293B,阻斷延遲整流鉀電流慢激活成分IKs。采用膜片鉗技術(shù)I-clamp模式:兩性霉素B(終濃度600ng/ml)加入電極內(nèi)液中,做穿孔膜片鉗

5、記錄。在0.25Hz、0.5Hz、1Hz不同頻率下記錄豚鼠心室肌細(xì)胞膜動(dòng)作電位。電極內(nèi)液成分為(mM):谷氨酸鉀120,KCl25,MgCl21,CaCl21,HEPES10(pH7.4 with KOH);電極外液分為(mM):NaCl138,KCl4,MgCl21,CaCl22,NaH2PO40.33,glucose10 and HEPES10(pH7.4 with NaOH)。
  通道激活的電流-電壓關(guān)系曲線用Boltzm

6、ann方程I/Imax=1/(1+exp[(Vt-V1/2)/k]擬合,其中V1/2為半數(shù)激活電壓。用OriginPro7.0,Adobe Illustrator10,SPSS19進(jìn)行圖象處理及數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以mean±SEM表示,兩組比較采用非配對(duì)Student's t檢驗(yàn),多組間比較采用ANOVA及Dunnett's post hoc檢驗(yàn)。P<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
  結(jié)果:1.對(duì)照組、醛固酮組、螺內(nèi)酯組、螺

7、內(nèi)酯合用醛固酮組血清鉀濃度、血清鈉濃度均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。同樣,我們前期的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)這種方式制備高醛固酮血癥豚鼠模型不影響豚鼠血壓。
  2.醛固酮長(zhǎng)期刺激延長(zhǎng)成年豚鼠心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位。在不同刺激頻率下(0.25 Hz、0.5 Hz、1Hz),醛固酮泵入組豚鼠左室心肌細(xì)胞APD90顯著延長(zhǎng)。
  3.醛固酮長(zhǎng)期刺激下調(diào)豚鼠心肌細(xì)胞IKs,但是醛固酮沒有改變通道的電壓依賴活性,對(duì)照組與醛固酮組半數(shù)激活電壓分

8、別是:37.4±2.8mV、39.3±2.0 mV,沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
  4.醛固酮并不影響IKr電流密度,也沒有改變其電生理學(xué)特性。表明醛固酮對(duì)鉀通道的調(diào)節(jié)作用具有選擇性。
  結(jié)論:醛固酮長(zhǎng)期刺激下調(diào)成年豚鼠心室肌細(xì)胞IKs,延遲心肌細(xì)胞復(fù)極化,而且不依賴于血壓升高和電解質(zhì)的紊亂。醛固酮并不影響IKr,表明醛固酮對(duì)鉀通道的調(diào)節(jié)作用具有選擇性。
  第二部分 醛固酮對(duì)體外培養(yǎng)成年豚鼠心肌細(xì)胞延遲整流鉀

9、電流的影響
  目的:為了驗(yàn)證整體高醛固酮血癥模型下延遲整流鉀電流的變化,進(jìn)一步觀察醛固酮對(duì)體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞延遲整流鉀電流的影響。
  方法:嚴(yán)格無菌操作急性分離成年豚鼠心肌細(xì)胞后,心肌細(xì)胞逐級(jí)覆鈣(200,500,1000,and1800μM)。靜置2h后去除死細(xì)胞。將醛固酮或DMSO溶劑分別加入新鮮培養(yǎng)基(Hyclone M199+Earle's salts和L-glutamine)。細(xì)胞放入培養(yǎng)基后在37℃,5% CO

10、2細(xì)胞孵育箱繼續(xù)孵育24小時(shí)。M199培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清、2mM L-肉毒奸、5mM肌氨酸、100IU·ml-1青霉素、鏈霉素100μg·ml-1。
  利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),記錄培養(yǎng)豚鼠心肌細(xì)胞IKs、IKr,觀察醛固酮在體外對(duì)培養(yǎng)心肌細(xì)胞延遲整流鉀電流的影響。
  結(jié)果:1.醛固酮孵育心肌細(xì)胞24小時(shí),下調(diào)心肌細(xì)胞IKs電流密度,此作用呈濃度依賴性。但醛固酮并不改變IKs通道的電壓依賴性的激活特性。
  2

11、.醛固酮(1μmol·L-1)孵育心肌細(xì)胞24小時(shí),不改變心肌細(xì)胞IKr電流密度,也不改變其電生理學(xué)特性。
  結(jié)論:與整體實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,在培養(yǎng)的成年豚鼠心肌細(xì)胞,醛固酮具有選擇性下調(diào)IKs電流密度的作用。
  第三部分 醛固酮下調(diào)心肌細(xì)胞延遲整流鉀電流慢激活成分的機(jī)制
  目的:利用整體動(dòng)物模型或體外培養(yǎng)細(xì)胞,探究醛固酮下調(diào)IKs的分子機(jī)制。
  方法:整體動(dòng)物給予醛固酮的方法同第一部分。為了評(píng)價(jià)醛固酮受體(M

12、R)的中介作用,部分給予醛固酮的動(dòng)物同時(shí)給予MR拮抗劑螺內(nèi)酯(100 mg·kg-1·day-1)灌胃。給藥28天后,比較聯(lián)合應(yīng)用螺內(nèi)酯與單用醛固酮組心室肌細(xì)胞IKs之間的差別。
  體外培養(yǎng)成年豚鼠心室肌細(xì)胞的方法同第一部分。為進(jìn)一步明確鹽皮質(zhì)激素受體途徑、血管緊張素ⅡAT1途徑以及細(xì)胞內(nèi)鈣介導(dǎo)醛固酮對(duì)IKs的影響,用以下工具藥物與醛固酮共同孵育分離的心肌細(xì)胞24小時(shí):MR拮抗劑螺內(nèi)酯10μmol·L-1、熱休克蛋白HSP90抑

13、制劑格爾德霉素1μmol·L-1、血管緊張素Ⅱ轉(zhuǎn)化酶抑制劑依那普利1μmol·L-1、AT1拮抗劑氯沙坦1μmol·L-1、L-型鈣通道阻斷劑尼莫地平1μmol·L-1、可膜通透性鈣離子螯合劑BAPTA-AM2.5μmol·L-1。
  利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),記錄培養(yǎng)豚鼠心肌細(xì)胞IKs,觀察這些工具要是否參與醛固酮對(duì)IKs的調(diào)節(jié)。
  成年豚鼠泵入醛固酮28天后或正常分離后的成年豚鼠心肌細(xì)胞經(jīng)醛固酮孵育24h,Trizol法

14、提取心肌細(xì)胞總RNA,明確醛固酮對(duì)成年豚鼠心肌細(xì)胞鉀通道KCNQ1、KCNE1以及ERG mRNA水平的影響。同時(shí)提取膜蛋白或全蛋白,做Westernblot分析,明確醛固酮對(duì)成年豚鼠心肌細(xì)胞上述鉀通道蛋白合成水平的影響。
  結(jié)果:1.不管是在體實(shí)驗(yàn),還是離體實(shí)驗(yàn),鹽皮質(zhì)激素受體(MR)拮抗劑螺內(nèi)酯可以完全防止醛固酮引起的心肌細(xì)胞下調(diào)IKs的作用。HSP90抑制劑格爾德霉素、血管緊張素Ⅱ轉(zhuǎn)化酶抑制劑依那普利、AT1拮抗劑氯沙坦等

15、分別與醛固酮共同孵育分離的心肌細(xì)胞24h后,可以逆轉(zhuǎn)醛固酮下調(diào)心肌細(xì)胞IKs。
  2.鈣通道拮抗劑尼莫地平、鈣螯合劑BAPTA-AM等分別與醛固酮共同孵育分離的心肌細(xì)胞24h后,不能逆轉(zhuǎn)醛固酮下調(diào)心肌細(xì)胞IKs,而且尼莫地平、BAPTA-AM本身下調(diào)心肌細(xì)胞IKs。
  3.成年豚鼠泵入醛固酮28天后,醛固酮抑制心肌細(xì)胞KCNQ1、KCNE1 mRNA轉(zhuǎn)錄及KCNQ1、KCNE1蛋白合成;而醛固酮不影響ERGmRNA轉(zhuǎn)錄及

16、蛋白合成。
  4.正常分離后的成年豚鼠心肌細(xì)胞與醛固酮孵育24h,醛固酮抑制心肌細(xì)胞KCNQ1、KCNE1蛋白合成及KCNQ1、KCNE1mRNA轉(zhuǎn)錄,而醛固酮不影響ERG mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白合成。
  結(jié)論:醛固酮通過經(jīng)典受體途徑,抑制心肌細(xì)胞KCNQ1、KCNE1mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白合成,下調(diào)心肌細(xì)胞IKs。醛固酮作用于心肌MR下調(diào)IKs過程中,MR受體與血管緊張素Ⅱ產(chǎn)生以及AT1之間可能存在相互作用。但是醛固酮下調(diào)IK

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