小鼠口腔癌模型骨髓播散細胞RB1CC1基因純合性缺失的初步研究.pdf

1、目的:(1)初步探討小鼠口腔癌模型骨髓單個播散細胞基因組的檢測方法。(2)初步探討小鼠口腔癌模型舌重度異常增生時期骨髓播散細胞RB1CC1基因純合性缺失及其意義。
　　方法:(1)4NQO飲水法建立小鼠口腔癌淋巴道轉(zhuǎn)移模型。定期處死小鼠，收集雙側(cè)股骨，F(xiàn)icoll密度梯度離心法提取骨髓單個核細胞層的細胞，并制作細胞涂片。以細胞角蛋白(CK)多克隆抗體為一抗免疫組化染色細胞涂片。小鼠的舌部進行常規(guī)HE染色檢測。(2)收集35只小鼠口

2、腔癌模型舌重度異常增生時期骨髓單個核細胞涂片，激光捕獲顯微切割技術(shù)(LCM)捕獲細胞涂片上的單個CK陽性(CK+)細胞。(3)單細胞全基因組擴增技術(shù)(WGA)擴增單個細胞的DNA。(4)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測其視網(wǎng)膜母細胞瘤誘導(dǎo)卷曲蛋白(RB1CC1)基因的第二、第六和第七外顯子純合性缺失情況，并與舌部正常，重度異常增生以及鱗癌組織各4例對照。
　　結(jié)果:(1)LCM切割46個CK+細胞，成功從35只小鼠骨髓涂片各捕獲1個CK

3、+細胞，總共35個細胞，成功率76％。(2)擴增CK+細胞35個，單細胞WGA擴增成功且PCR成功擴增出內(nèi)參GAPDH的單細胞為3個，成功率8.6％。(3)RB1CC1基因第二外顯子純合性缺失情況分別為單個CK+細胞(2/3)，舌癌變組織(2/4)，舌部正常組織(0/4)，重度異常增生組織(0/4);RB1CC1基因第六外顯子純合性缺失情況分別為單個CK+細胞(0/3)，舌癌變組織(0/4)，舌部正常組織(0/4)，重度異常增生組織(0