HSP70阻抑應(yīng)激心肌細胞凋亡Fas通路的FAF1調(diào)控機制.pdf

1、應(yīng)激是機體在應(yīng)對生存環(huán)境多種不利因素過程中，認知或?qū)嶋H上的需求與應(yīng)對能力之間不平衡所導(dǎo)致的機體的心理生理緊張狀態(tài)及其反應(yīng)。長期的高應(yīng)激負荷可導(dǎo)致心功能紊亂、高血壓、動脈粥樣硬化等多種嚴重心血管疾病的發(fā)生。心肌細胞凋亡是心肌損傷發(fā)生的重要細胞學(xué)基礎(chǔ)之一，F(xiàn)as信號通路是心肌細胞凋亡的重要途徑。前期研究發(fā)現(xiàn)HSP70可阻抑Fas通路的活化以減緩應(yīng)激所致心肌細胞凋亡的發(fā)生，但對其分子機制尚不清楚。FAF1(Fas-associated fac

2、tor-1)作為死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物(death inducing signaling complex，DISC)的重要組成部分，對于Fas通路活化具有重要的調(diào)控作用，被稱為Fas通路的重要調(diào)控元件。對FAF1分子結(jié)構(gòu)的分析表明，HSP70、Fas與FAF1的結(jié)合位點存在著明顯的重疊區(qū)，在FAF1分子的82-180氨基酸區(qū)域，HSP70、Fas與FAF1結(jié)合域甚至完全相同，提示了HSP70、Fas在與FAF1的結(jié)合中存在著相互競爭性抑制的

3、可能性。因此，認識應(yīng)激心肌細胞中FAF1表達水平的變化規(guī)律及其對應(yīng)激心肌細胞凋亡Fas通路的影響，揭示FAF1在HSP70阻抑應(yīng)激心肌細胞凋亡Fas通路中的節(jié)點調(diào)控作用，認識FAF1與HSP70相互作用對Fas-FAF1相互作用及DISC形成的影響，發(fā)現(xiàn)FAF1在HSP70阻抑應(yīng)激心肌細胞凋亡Fas通路中生物學(xué)作用的分子基礎(chǔ)，有助于闡明應(yīng)激致心肌細胞凋亡的生物學(xué)基礎(chǔ)，對于HSP70阻抑應(yīng)激致心肌細胞凋亡機制的研究，有助于探索和發(fā)現(xiàn)防治應(yīng)

4、激致心血管損傷的新的醫(yī)學(xué)途徑。
　　一、應(yīng)激致心肌細胞凋亡模型中FAF1的表達規(guī)律
　　結(jié)合本實驗室前期研究，選取180-200g Wistar大鼠以間歇式束縛應(yīng)激模式誘導(dǎo)應(yīng)激動物模型建立，應(yīng)用本實驗室研制的大鼠束縛艙對大鼠進行每天6h的束縛應(yīng)激，三個應(yīng)激組大鼠束縛應(yīng)激持續(xù)時間為1w、2w和3w，對照組大鼠不進行束縛應(yīng)激。建模完成后，應(yīng)激2w和3w組大鼠血漿中糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)和去甲腎上腺素(N

5、orepinephrine，NE)水平較對照組顯著升高;心肌組織TUNEL染色顯示，應(yīng)激組大鼠心肌組織中細胞凋亡率較對照組顯著升高，表明束縛應(yīng)激致大鼠心肌損傷模型成功建立。采用western blot檢測應(yīng)激致心肌細胞凋亡的動物模型中心肌組織FAF1的表達水平，可見FAF1水平隨束縛應(yīng)激時間的增長而逐漸升高，并與應(yīng)激心肌細胞的凋亡率具有明確的相關(guān)性規(guī)律。
　　依據(jù)束縛應(yīng)激大鼠血漿NE水平，分別對四組H9c2細胞給予0μM，5μM，

6、20μM，50μM NE干預(yù)36h，構(gòu)建應(yīng)激致心肌細胞凋亡的細胞模型，通過流式細胞術(shù)檢測不同劑量NE干預(yù)下H9c2細胞的凋亡率。結(jié)果顯示，NE可誘導(dǎo)H9c2細胞的凋亡，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系，應(yīng)激致心肌細胞凋亡模型構(gòu)建成功。采用western blot檢測應(yīng)激細胞中FAF1的表達水平，F(xiàn)AF1表達水平隨NE濃度的增加而逐漸升高，與應(yīng)激細胞的凋亡率也存在相關(guān)性。
　　二、FAF1在應(yīng)激心肌細胞凋亡中的生物學(xué)功能
　　在應(yīng)激心肌細胞

7、凋亡模型中，采用western blot檢測FAS蛋白表達水平，采用caspase-8活性檢測試劑盒檢測NE作用下H9c2細胞中caspase-8的活性水平，應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。結(jié)果顯示，NE可顯著升高細胞中的FAS表達水平，且caspase-8活性亦顯著升高，提示應(yīng)激心肌細胞中Fas通路的活化。構(gòu)建并轉(zhuǎn)染FAF1高表達載體，調(diào)控心肌細胞中FAF1表達水平升高;設(shè)計并合成了FAF1的siRNA，特異性敲低細胞FAF1表達水平，

8、觀察不同F(xiàn)AF1表達水平對細胞FAS通路活化狀態(tài)和細胞凋亡水平影響。研究結(jié)果顯示，在50μM NE誘導(dǎo)的應(yīng)激心肌細胞中，F(xiàn)AF1的高表達可誘導(dǎo)心肌細胞中caspase-8活性和細胞凋亡率顯著升高;而siRNA抑制FAF1表達后，caspase-8活性和細胞凋亡率明顯下降。心肌細胞FAF1水平與細胞caspase-8活性和細胞凋亡率存在正相關(guān)關(guān)系，表明了FAF1在心肌細胞中發(fā)揮促凋亡的作用。
　　三、HSP70在應(yīng)激致心肌細胞凋亡進

9、程中的調(diào)控作用
　　構(gòu)建HSP70高表達載體并轉(zhuǎn)染H9c2細胞，調(diào)控細胞內(nèi)HSP70高表達;應(yīng)用熱休克蛋白抑制劑KNK437阻抑H9c2細胞內(nèi)HSP70表達;分別給予上述HSP70高表達或表達抑制的H9c2細胞以50μM NE干預(yù)36h，建立不同HSP70水平的應(yīng)激心肌細胞模型。應(yīng)用western blot檢測細胞中FAS水平，應(yīng)用caspase-8活性檢測試劑盒檢測caspase-8活性，研究HSP70表達水平對應(yīng)激心肌細胞凋亡

10、的影響。結(jié)果表明，高表達HSP70能降低細胞中FAS表達水平，并繼而降低caspase-8活性;抑制HSP70表達水平，則引起FAS表達水平和caspase-8活性水平的升高。提示HSP70對應(yīng)激所致心肌細胞凋亡Fas通路的激活具有明顯的抑制作用，從而降低應(yīng)激所導(dǎo)致的心肌細胞凋亡，對心肌細胞產(chǎn)生重要的保護作用。
　　四、FAF1在HSP70阻抑心肌細胞凋亡Fas通路中的生物學(xué)作用及其機制
　　采用免疫共沉淀技術(shù)檢測H9c2細

11、胞中HSP70、FAF1及FAS的相互作用。結(jié)果表明，HSP70與FAF1之間、FAS與FAF1之間均存在相互作用。構(gòu)建HSP70全長序列高表達載體pEGFP-rHSP70和HSP70 N末端1-120位氨基酸缺失的突變體pEGFP-N1/rHsp70△N-(121-642)，轉(zhuǎn)染至H9c2細胞后，采用免疫共沉淀技術(shù)檢測HSP70與FAF1之間的相互作用，結(jié)果顯示，N末端1-120位氨基酸缺失的HSP70突變體不再與FAF1產(chǎn)生相互作用

12、，表明HSP70與FAF1的作用區(qū)域是位于HSP70 N末端的1-120位氨基酸區(qū)域。
　　在H9c2細胞中轉(zhuǎn)染HSP70全長序列高表達載體，調(diào)控細胞內(nèi)HSP70高表達，采用免疫共沉淀技術(shù)檢測FAS與FAF1的相互作用。研究結(jié)果表明，與對照組相比，高表達HSP70的細胞中，與FAS相互作用的FAF1水平降低，細胞中Fas通路活化水平下降。HSP70的表達水平對FAS-FAF1相互作用及DISC形成具有重要影響，對應(yīng)激心肌細胞的凋亡

13、具有重要的調(diào)節(jié)作用。
　　在50μM NE干預(yù)的H9c2細胞中，分別轉(zhuǎn)染HSP70全長序列高表達載體和HSP70 N末端1-120位氨基酸缺失的突變體，采用caspase-8活性檢測試劑盒檢測H9c2細胞中caspase-8的活性水平，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染全長序列HSP70高表達載體可顯著緩解NE引起的細胞caspase-8活性的升高和細胞凋亡率的升高，而轉(zhuǎn)染HSP70 N末端1-120位氨基酸缺失突變體的

14、細胞中，NE引起的caspase-8活性的升高和細胞凋亡率的升高未見明顯降低。這表明FAF1與HSP70之間的相互作用可影響Fas通路的活化程度，與HSP70對應(yīng)激心肌細胞的保護作用密切相關(guān)。
　　綜上所述，本研究在動物和細胞水平上系統(tǒng)研究了應(yīng)激心肌細胞FAF1在HSP70對應(yīng)激心肌細胞保護機制中的生物學(xué)作用及其分子機制。研究結(jié)果表明，應(yīng)激狀態(tài)下，心肌細胞中FAF1高表達，并進一步促進心肌細胞Fas通路的活化，誘導(dǎo)細胞凋亡。HSP

15、70通過與FAS競爭性結(jié)合FAF1，弱化了FAF1和FAS的相互作用，阻抑了DISC的形成，抑制了caspase-8活化所介導(dǎo)Fas通路的活化，對應(yīng)激心肌細胞凋亡通路具有重要的節(jié)點調(diào)控作用。FAF1是HSP70阻抑應(yīng)激心肌細胞凋亡Fas通路的重要作用靶點。本研究結(jié)果揭示了HSP70對應(yīng)激心肌細胞保護作用的重要分子機制，這對于闡明心肌細胞應(yīng)激的生物學(xué)基礎(chǔ)、探索HSP70抑制應(yīng)激心肌細胞凋亡的機制、開拓防治應(yīng)激致心血管損傷的新的醫(yī)學(xué)途徑具有