夏氏瘧原蟲感染小鼠中調(diào)節(jié)性B細(xì)胞數(shù)量和表型的研究.pdf

1、瘧疾是由瘧原蟲通過媒介昆蟲傳播感染引起的嚴(yán)重威脅人類生命的感染性疾病，已成為全球最嚴(yán)重的三大公共衛(wèi)生問題之一。目前尚未有應(yīng)用于臨床的有效瘧疾疫苗。因此，抗瘧疾疫苗的研制成為了當(dāng)今的重點(diǎn)課題，而瘧原蟲感染宿主機(jī)體應(yīng)答的免疫學(xué)、分子生物學(xué)等綜合研究是其重要前提。
　　瘧疾與其他大多數(shù)感染性疾病一樣，需要通過免疫效應(yīng)機(jī)制對(duì)其控制和消除。在感染早期，以IFN-γ為主導(dǎo)的Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答遏制原蟲的爆發(fā)性增殖。隨之，有Th2型細(xì)胞輔助B細(xì)

2、胞產(chǎn)生特異性抗體，能夠有效清除瘧原蟲，防止復(fù)發(fā)和再燃。適時(shí)適度的的Th1/Th2應(yīng)答具有保護(hù)作用，而過度或不恰當(dāng)?shù)膽?yīng)答可能導(dǎo)致病理性損傷。
　　調(diào)節(jié)性B(Bregs)是能夠分泌Th2型細(xì)胞因子IL-10的B細(xì)胞，有研究發(fā)現(xiàn)伯氏瘧原蟲感染能夠誘導(dǎo)小鼠脾臟產(chǎn)生Bregs，能夠有效抑制病理性免疫應(yīng)答導(dǎo)致的腦瘧從而延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間。但調(diào)節(jié)性B細(xì)胞在抗瘧疾保護(hù)性免疫應(yīng)答中的作用和地位并不清楚。研究顯示，瘧疾保護(hù)性免疫應(yīng)答中Th1應(yīng)答向Th2

3、型應(yīng)答的轉(zhuǎn)換需要B細(xì)胞參與，在重癥瘧疾貧血患兒體內(nèi)B細(xì)胞數(shù)量和表型存在異常。由此推測(cè)，瘧原蟲感染可誘導(dǎo)Bregs活化，在保護(hù)性和病理性應(yīng)答的平衡中發(fā)揮重要而獨(dú)特作用。
　　目的：
　　C57BL/6小鼠可以產(chǎn)生較強(qiáng)烈的Th1型應(yīng)答，而BALB/c小鼠則偏向Th2型應(yīng)答，因此我們建立了不同P.c chabadui AS感染鼠瘧模型。本研究利用夏氏瘧原蟲感染的C57BL/6和BALB/c小鼠模型，通過檢測(cè)Bregs在不同初次和再

4、次感染中的應(yīng)答模式、與Th1/Th2極化的關(guān)系，以及表型變化，揭示Bregs在瘧疾免疫應(yīng)答中的作用。
　　方法：
　　1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和瘧原蟲
　　6～8周雌性C57BL/6與BALB/c小鼠，SPF級(jí)，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供（許可證編號(hào):SCXK京200420001）。致死型夏氏瘧原蟲(Plasmodium chabadudi chabadui AS，P.c chabadui AS)液氮凍存，由BALB/c小

5、鼠周期復(fù)蘇傳代。
　　2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染
　　瘧疾感染:C57BL/6與BALB/c每只小鼠經(jīng)腹腔感染1×106P.c chabadui AS寄生紅細(xì)胞(pRBC)。P.c.AS感染后第3天開始，尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)瘧原蟲血癥水平、生存率。
　　3、流式細(xì)胞術(shù)
　　FACS檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞中產(chǎn)生IL-10的CD11b、CD19及CD3的水平，并檢測(cè)分泌IL-10的CD19細(xì)胞中CD1d、

6、CD5、IgM、IgD、IgG、B220及CD138等的表達(dá)量。
　　4、Realtime PCR檢測(cè)細(xì)胞因子
　　TRIzo1勻漿提取脾臟組織mRNA，反轉(zhuǎn)錄為eDNA后，保存于-20℃作為Realtime PCR的模板，將RPS17作為內(nèi)參基因，檢測(cè)IL-I0基因表達(dá)水平。
　　5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，標(biāo)本采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)做統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)

7、學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、P.c chabadui AS感染小鼠原蟲血癥水平和生存率
　　C57BL/6與BALB/c小鼠經(jīng)腹腔感染1×106 P.c chabaudi AS寄生的紅細(xì)胞(pRBC)后，于感染后第4天在外周血可見瘧原蟲感染的紅細(xì)胞，隨后紅細(xì)胞感染率迅速上升。在感染后第8天紅細(xì)胞感染率達(dá)到峰值(36％)。隨后C57BL/6小鼠的感染率開始迅速下降，并在感染后第13天被基本清除，而BALB/c小鼠的感染

8、率下降緩慢，在感染后第9天開始出現(xiàn)死亡，感染后第11左右基本全部死亡。
　　2、P.c chabadui AS感染小鼠脾細(xì)胞IL-10的分泌水平及來源
　　C57BL/6小鼠脾組織中IL-10 mRNA水平及分泌IL-10細(xì)胞的數(shù)量在感染后第8天達(dá)到峰值，BALB/c小鼠在感染后第5天達(dá)到峰值。分泌IL-10細(xì)胞的數(shù)量約占小鼠脾細(xì)胞總數(shù)的5％，并隨小鼠的原蟲血癥的升高而升高。
　　C57BL/6和BALB/c小鼠脾淋巴

9、細(xì)胞中分泌IL-I0的細(xì)胞主要為CD3+T細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞。C57BL/6小鼠在感染后第8天CD19+IL-10+B細(xì)胞數(shù)量達(dá)到峰值，占脾淋巴細(xì)胞總數(shù)的1.9％，在分泌IL-10細(xì)胞中的比重為40％。CD3+IL-10+T細(xì)胞數(shù)量的峰值出現(xiàn)在感染后第5天，占脾淋巴胞總數(shù)3％。BALB/c小鼠CD19+IL-10+B細(xì)胞和CD3+IL-10+細(xì)胞的峰值出現(xiàn)在感染后第5天，分別占脾淋巴細(xì)胞總數(shù)的3.4％和2.6％，其中CD19+B細(xì)胞

10、占分泌IL-10細(xì)胞的50％，且在感染初期CD19+IL-10+B細(xì)胞數(shù)量多于CD3+IL-10+細(xì)胞數(shù)量。
　　3、在P.c chabadui AS感染模型中B10細(xì)胞亞群的變化
　　B10細(xì)胞表型為CD19+CD5+CD1dhi，被認(rèn)為是表達(dá)IL-10主要調(diào)節(jié)性B細(xì)胞亞群。在本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭邪l(fā)現(xiàn)，在感染初期CD19+IL-10+細(xì)胞中只有部分表達(dá)CD5及CD1d，感染后第8天，脾細(xì)胞中CD19+IL-10+細(xì)胞約占脾細(xì)胞總數(shù)

11、的2％，其中主要為CD5ˉCD1dˉBregs。
　　4、P.c chabadui AS感染第8天后小鼠脾淋巴細(xì)胞中CD19+IL-10+非B10細(xì)胞表型特點(diǎn)
　　在感染后第8天，小鼠脾淋巴細(xì)胞中CD19+IL-10+為非B10細(xì)胞，其高表達(dá)IgG和B220（表達(dá)量為80％），低表達(dá)IgM和IgD（表達(dá)量為20％），不表達(dá)CD5、CD1d和CD138。
　　5、二次感染P.c chabadui AS小鼠脾淋巴細(xì)胞中CD

12、19+ IL-10+細(xì)胞的數(shù)量和表型特點(diǎn)
　　在C57BL/6小鼠二次感染P.c chabadui AS中發(fā)現(xiàn)CD19+IL-10+B細(xì)胞數(shù)量的峰值出現(xiàn)在感染后第5天，相較首次感染有所提前。并且小鼠脾淋巴細(xì)胞中CD19+IL-10+B細(xì)胞的表型與初次感染相似，均為非B10的IgG+Bregs細(xì)胞。
　　結(jié)論：
　　1、 P.c chabadui AS感染后小鼠脾細(xì)胞中IL-10的分泌水平明顯升高;
　　2、Bre