泛素特異性蛋白酶USP22及其SNPs對Hela細胞凋亡及細胞周期調(diào)控作用的研究.pdf

1、USP22是人類基因組編碼的54種泛素特異性蛋白酶(Ubiquitin-specific protease)之一。為了證實USP22去泛素化酶活性在調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機制，本研究用siRNA敲除HeLa細胞中的USP22，證實其可以引起細胞周期阻滯，而這種調(diào)控作用主要依賴于其去泛素化酶活性。本文主要從以下幾部分展開論述:
　　第一部分 在Hela細胞中用siRNA沉默泛素特異性蛋白酶USP22基因?qū)毎芷诤偷蛲龅挠绊?b

2、r>　　目的:
　　選擇宮頸癌細胞中的HeLa細胞作用研究對象，觀察USP22對HeLa細胞凋亡和細胞周期的調(diào)控作用，從而為宮頸癌的治療提供幫助。
　　方法:
　　1.設計針對USP22基因的特異性siRNA序列。
　　2.檢測沉默USP22基因?qū)eLa細胞凋亡的影響。
　　3.檢測沉默USP22基因?qū)毎芷谙嚓P(guān)的一些因子的影響。
　　結(jié)果:
　　1.USP22 siRNA對USP22基因表

3、達的影響:HeLa細胞在轉(zhuǎn)染三種USP22 siRNA及對照siRNA片段72小時后，USP22 siRNA組的mRNA水平上基因表達均明顯下調(diào)(P＜0.05)。USP22 siRNA-1效果最明顯，72小時沉默效果最好。
　　2.沉默USP22基因?qū)eLa細胞凋亡和細胞周期的影響。
　　3.檢測USP22調(diào)控HeLa細胞周期的機制。
　　結(jié)論:
　　1.USP22 siRNA-1沉默效果最佳，最佳沉默時間為7

4、2小時。
　　2.流式細胞術(shù)檢測結(jié)果說明，USP22對HeLa細胞的凋亡不產(chǎn)生影響，USP22表達水平的下降可以引起HeLa細胞細胞周期阻滯，使其停留在G1期，從而可以抑制細胞的增殖。
　　3.USP22可以通過調(diào)節(jié)細胞周期來調(diào)節(jié)HeLa細胞的增殖，這一作用可能是通過c-Myc/cyclin D2，BMI-1和p53的途徑來實現(xiàn)的。
　　第二部分 泛素特異性蛋白酶USP22的去泛素化酶活性對其調(diào)控HeLa細胞周期作用的

5、影響
　　目的:
　　為了進一步探討USP22酶活性與這一調(diào)節(jié)作用之間的關(guān)系，本部分擬構(gòu)建失活突變體USP22(C185S)，采用本研究室建立的以Ub-Met-β-gal和pGEX-Ub52為底物的去泛素化酶活性檢測體系檢測USP22(C185S)的酶活性的變化，并檢驗USP22失活之后對HeLa細胞細胞周期的影響，以便進一步了解USP22在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機制，從而為宮頸癌的治療尋找新的治療靶點奠定分子理論基礎。<

6、br>　　方法:
　　1.pGEX-USP22質(zhì)粒和pAC-T7-USP22質(zhì)粒的構(gòu)建。
　　2.pGEX-USP22(C185S)突變質(zhì)粒和pAC-T7-USP22(C185S)的構(gòu)建。
　　3.采用GST-Ub52模型底物和Ub-Met-β-gal模型底物對野生型USP22(WT)和失活突變體USP22(C185S)進行去泛素化酶活性分析，Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描。
　　4.檢測沉默USP22基

7、因?qū)eLa細胞凋亡及細胞周期相關(guān)因子的影響。
　　結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建野生型USP22及失活突變體USP22(C185S)質(zhì)粒。
　　2.檢測pGEX-USP22(C185S)和pAC-T7-USP22(C185S)對酶活性的影響。
　　3.檢測USP22去泛素化酶活性對HeLa細胞凋亡的影響。
　　4.檢測USP22去泛素化酶活性對HeLa細胞周期的影響。
　　5.檢測USP22去泛素化酶活性

8、對細胞周期相關(guān)的一些因子的影響:USP22(WT)可以上調(diào)BMI-1，c-Myc，cyclin D2的表達水平，下調(diào)p53表達水平。而轉(zhuǎn)染pEGFP-USP22(C185S)組，這四個因子的水平與轉(zhuǎn)染對照pEGFP-C1組沒有明顯差別，說明USP22對BMI-1，c-Myc，cyclin和p53的調(diào)控作用也是依賴于其去泛素化酶活性的。
　　結(jié)論:
　　1.USP22的活性與其調(diào)控HeLa細胞的細胞周期相關(guān)，USP22在失去活

9、性后，對HeLa細胞的細胞周期就失去其調(diào)節(jié)功能。
　　2.USP22在失去活性后對細胞周期相關(guān)的因子p53，BMI-1，c-Myc，cyclin D2也不具有調(diào)節(jié)作用。
　　第三部分 泛素特異性蛋白酶USP22基因錯義突變對去泛素化酶活性的影響及意義
　　目的:
　　前面的研究證實USP22可以調(diào)節(jié)HeLa細胞的細胞周期，而這一調(diào)節(jié)作用與USP22的去泛素化酶活性密切相關(guān)。目前對于USP22的單核苷酸多態(tài)性對其活

10、性的影響還知之甚少，因此將在NCBI上檢索到的4個錯義突變作為研究對象，研究這四個突變體對去泛素化酶活性的影響，并選擇有活性變化的突變體轉(zhuǎn)染至HeLa細胞，觀察其對細胞周期的調(diào)節(jié)作用，以便進一步了解USP22在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機制。
　　方法:
　　1.USP22(R98W), USP22(N283S), USP22(P290L)和USP22(Y513C)突變質(zhì)粒的構(gòu)建:采用本室保存的pGEX-USP22(WT)質(zhì)粒

11、為模板，定點突變R98W，N283S，P290L和Y513C位點，構(gòu)建人的pGEX-USP22(R98w), pGEX-USP22(N283S), pGEX-USP22(P290L)和pGEX-USP22(Y513C)突變質(zhì)粒和pAC-T7-USP22(R98W), pAC-T7-USP22(N283S), pAC-T7-USP22(P290L)和pAC-T7-USP22(Y513C)質(zhì)粒。
　　2.去泛素化酶活性檢測:采用GST

12、-Ub52模型底物和Ub-Met-β-gal模型底物對四個突變體進行去泛素化酶活性分析，Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描。
　　3.檢測USP22(Y513C)對HeLa細胞凋亡的影響:將USP22(Y513C)轉(zhuǎn)染至HeLa細胞中，用流式細胞術(shù)檢測各組的細胞凋亡情況及細胞周期的分布情況。
　　4.檢測USP22(Y513C)對細胞周期相關(guān)的一些因子的影響:將USP22(Y513C)轉(zhuǎn)染至HeLa細胞中，然后用qRT-

13、PCR的方法檢測BMI-1，c-Myc，cyclin D2及p53的表達情況。
　　結(jié)果:
　　1.構(gòu)建USP22(R98W),USP22(N283S), USP22(P290L)和USP22(Y513C)突變質(zhì)粒:測序結(jié)果證實pGEX-6P-1和pAC-T7中成功插入了USP22(R98W)，USP22(N283S)，USP22(P290L)和USP22(Y513C)序列，證明突變和換載成功。
　　2.檢測USP22

14、（R98W），USP22(N283S)，USP22(P290L)和USP22(Y513C)對酶活性的影響:USP22（R98W），USP22(N283S)，USP22(P290L)突變作用于模型底物GST-Ub52和Ub-Met-β-gal模型底物的去泛素化酶活性分析的結(jié)果與野生型USP22差異無統(tǒng)計學意義，USP22(Y513C)的去泛素化酶活性分析的結(jié)果與野生型USP22相比顯著下降，在Ub-Met-β-gal模型底物活性檢測體系中

15、USP22(Y513C)完全失去了去泛素化酶活性，在GST-Ub52模型底物活性檢測體系中，USP22(Y513C)的活性也明顯下降，下降至野生型USP22的1.7％。
　　3.USP22(Y513C)對HeLa細胞凋亡的影響:將pEGFP-C1、 pGEX-USP22(WT)、pGEX-USP22(C185S)和pGEX-USP22(Y513C)分別轉(zhuǎn)染至HeLa細胞中，流式細胞檢測結(jié)果顯示四組之間差異無統(tǒng)計學差異。USP22(

16、Y513C)去泛素化酶活性的下降使其調(diào)控HeLa細胞周期的功能消失，也就進一步說明USP22對HeLa細胞周期的調(diào)控是依賴于其去泛素化酶活性的。
　　4.USP22(Y513C)對細胞周期相關(guān)的一些因子的影響:轉(zhuǎn)染pEGFP-USP22(Y513C)組中，這四個因子的水平與轉(zhuǎn)染對照pEGFP-C1組沒有明顯差別，進一步說明USP22對BMI-1，c-Myc，cyclin D2和p53的調(diào)控作用是依賴于其去泛素化酶活性的。