銀杏葉提取物對(duì)高磷誘導(dǎo)的慢性腎臟病大鼠血管鈣化作用的研究.pdf

1、目的：
　　心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是慢性腎臟病(chronic kidneydisease，CKD)患者的主要并發(fā)癥之一，也是CKD患者的主要致死亡原因。血管鈣化是CKD中普遍存在的臨床表現(xiàn)，是發(fā)生心血管致死的強(qiáng)大的預(yù)測(cè)因素。對(duì)于血管鈣化，至今仍沒(méi)有公認(rèn)有效的治療方案，因此，了解CKD血管鈣化發(fā)生的機(jī)制及其可能的有效防治措施，對(duì)于防治慢性腎臟病患者心血管并發(fā)癥意義重大。近年來(lái)的研究表明，

2、CKD血管鈣化由血管鈣化的促進(jìn)與抑制因子失衡引起，其機(jī)制極為復(fù)雜，與多種危險(xiǎn)因素相關(guān)。大量流行病學(xué)和臨床研究的資料表明高磷血癥是CKD患者血管鈣化、血管硬度增加繼而發(fā)生CVD的主要危險(xiǎn)因素。
　　近年來(lái)，很多中藥制劑因其毒副作用少、治療效果肯定在臨床上得到了廣泛應(yīng)用。EGb761是應(yīng)用現(xiàn)代工藝獲得的銀杏葉標(biāo)準(zhǔn)提取物，其通過(guò)抗氧化、抗炎、抗血小板聚集、抗凋亡、調(diào)節(jié)血管生成及功能等多個(gè)信號(hào)途徑，對(duì)改善心肌缺血、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、動(dòng)脈粥樣硬

3、化斑塊形成具有明顯的效果。然而，EGb761對(duì)高磷介導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞鈣化有何影響尚不明確，而且EGb761對(duì)慢性腎臟病血管鈣化的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　由于高磷通過(guò)增加線粒體ROS的產(chǎn)生促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)鈣化，而EGb761具有抗氧化活性，可減少線粒體ROS產(chǎn)生，因此我們推測(cè)，EGb761可能通過(guò)減少線粒體ROS的產(chǎn)生而抑制平滑肌細(xì)胞鈣化，從而對(duì)慢性腎臟病血管鈣化發(fā)揮一定程度的改善作用。
　　方法：<

4、br>　　為了探明EGb761對(duì)慢性腎臟病血管鈣化的作用，本研究將分為體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。第一部分以體外培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞為模型，通過(guò)在高磷狀態(tài)下誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化，檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路和成骨信號(hào)分子的表達(dá)以及細(xì)胞鈣含量，觀察β-磷酸甘油聯(lián)合或不聯(lián)合EGb761對(duì)血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響。第二部分通過(guò)高磷飲食誘導(dǎo)建立殘腎大鼠慢性腎臟病血管鈣化模型，給予含EGb761的飼料進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)動(dòng)物動(dòng)脈鈣化的影響，進(jìn)一步探明其作用

5、及分子機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)步驟如下:
　　1.采用組織塊貼壁法對(duì)大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)并鑒定后，分組使用β-磷酸甘油、不同濃度的EGb761干預(yù)培養(yǎng)7天。
　　2.分組對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣含量、細(xì)胞內(nèi)蛋白含量、堿性磷酸酶活性、線粒體活性氧自由簇含量和NF-κB活性進(jìn)行測(cè)定，并定量PCR檢測(cè)大鼠血管平滑肌細(xì)胞核心結(jié)合因子(Cbfα1)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smoot muscle actin，α-SM actin)mRNA的

6、表達(dá)情況，以判斷不同濃度EGb761在血管平滑肌細(xì)胞鈣化過(guò)程中的作用。
　　3.通過(guò)高磷誘導(dǎo)建立殘腎大鼠慢性腎臟病血管鈣化模型，并應(yīng)用EGb761進(jìn)行干預(yù)16周后測(cè)定大鼠血清尿素氮、肌酐、鈣、磷指標(biāo)。
　　4.用Von Kossa染色測(cè)定大鼠胸主動(dòng)脈鈣化的情況，并對(duì)大鼠腹主動(dòng)脈鈣含量進(jìn)行測(cè)定，蛋白免疫印跡法檢測(cè)大鼠胸主動(dòng)脈上段NF-κB p65、核心結(jié)合因子α1(Cbfα1)和α-SM actin的蛋白含量，探討EGb761

7、在慢性腎臟病血管鈣化中的作用。
　　結(jié)果：
　　1.BGP鈣化干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)鈣含量顯著高于陰性對(duì)照組(P＜0.01)，加入不同濃度的EGb761后，大鼠血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣含量降低(P＜0.05)，而且降低程度跟加入的EGb761呈濃度依賴(lài)性。
　　2.高磷可誘導(dǎo)細(xì)胞堿性磷酸酶的高表達(dá)、上調(diào)NF-κB活性、增加線粒體ROS產(chǎn)生、增加Cbfα1 mRNA的基因表達(dá)、降低α-SM actin mRNA的基因表達(dá)(P＜0.05)

8、，在培養(yǎng)液中加入相應(yīng)濃度的EGb761后，堿性磷酸酶的表達(dá)下降、NF-κB活性下降、線粒體ROS減少、Cbfα1 mRNA的基因表達(dá)下降、α-SM actinmRNA的基因表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，而且效果與加入的EGb761呈劑量依賴(lài)關(guān)系。
　　3.殘腎大鼠慢性腎臟病血管鈣化模型干預(yù)16周后取血化驗(yàn)發(fā)現(xiàn)血清尿素氮、肌酐、磷明顯高于陰性對(duì)照組，說(shuō)明5/6腎切除+高磷飲食法誘導(dǎo)大鼠慢性腎功能衰竭成功，但EGb761干預(yù)組和單純高磷飲

9、食組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.大鼠胸主動(dòng)脈Von Kossa染色和腹主動(dòng)脈鈣含量測(cè)定證實(shí)高磷可誘導(dǎo)殘腎大鼠慢性腎臟病血管鈣化，加入EGb761干預(yù)可以減輕血管鈣化。
　　5.EGb761可以抑制慢性腎臟病血管鈣化大鼠主動(dòng)脈中NF-κB p65、cbfα1的蛋白表達(dá)，上調(diào)α-SM actin蛋白表達(dá)，抑制血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化。
　　結(jié)論：
　　1、EGb761可降低β-磷酸甘油誘導(dǎo)的大鼠動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞