27nt miRNA對eNOS調(diào)節(jié)及HUVECs增殖相關(guān)因子AP-1作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　前期工作發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮型一氧化氮合酶第4內(nèi)含子的27堿基重復(fù)子產(chǎn)生相應(yīng)27nt miRNA，并對eNOS的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。進(jìn)一步探討該內(nèi)含子源性27nt miRNA對內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因調(diào)節(jié)的分子機(jī)制及臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子AP-1的作用機(jī)制。
　　1.明確27nt miRNA對內(nèi)皮細(xì)胞表型的調(diào)控作用
　　2.闡明27nt miRNA抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的機(jī)制。
　　3.旨在從新的

2、角度闡明內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的分子機(jī)制，為尋找新的心血管疾病治療靶點提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.體外觀察27nt miRNA對內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響:將人工合成的wt-27nt miRNA和mut-27nt miRNA mimics分別轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞，觀察內(nèi)皮細(xì)胞的增殖（MTT法和細(xì)胞克隆法）、遷移（細(xì)胞劃痕實驗）、侵襲（Transwell實驗）等生物學(xué)行為的變化。
　　2.27nt miRNA下游靶基因的

3、預(yù)測、驗證和功能研究:我們使用TargetScan靶基因預(yù)測軟件并分析相關(guān)因素，篩選27nt miRNA可能的下游靶基因AP-1。然后。應(yīng)用熒光素酶報告系統(tǒng)驗證27nt miRNA對AP-1的負(fù)性調(diào)控作用。進(jìn)一步采用qRT-PCR、免疫組化和免疫印跡實驗(western blotting)檢測靶基因AP-1 mRNA和蛋白和eNOSmRNA和蛋白表達(dá)水平的改變。
　　3.在VEGF生長因子刺激下，進(jìn)一步采用qRT-PCR和免疫印跡

4、實驗(western blotting)檢測共轉(zhuǎn)染27nt miRNA和AP-1后eNOS mRNA和蛋白表達(dá)水平的改變，最后應(yīng)用MTT法觀察內(nèi)皮細(xì)胞的增殖情況。
　　結(jié)果:
　　1.過表達(dá)27nt miRNA對內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移以及侵襲具有顯著的抑制作用，
　　2.通過生物信息學(xué)的預(yù)測發(fā)現(xiàn)，AP-1可能是27nt miRNA的下游一個靶基因，熒光素酶報告表明，27nt miRNA對于它結(jié)合位點熒光報告基因活性具有顯

5、著抑制作用，但其對突變體和對照質(zhì)粒的活性卻沒有顯著性的影響。前期工作發(fā)現(xiàn)，eNOS不是27nt miRNA的預(yù)測靶基因，過表達(dá)27nt miRNA對eNOS mRNA以及蛋白表達(dá)水平有明顯影響。以上研究證實27nt miRNA通過轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控AP-1參與內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　3.在VEGF的刺激下，共轉(zhuǎn)染27nt miRNA和AP-1對eNOS mRNA和蛋白水平影響更為顯著。
　　結(jié)論:
　　1.過表達(dá)2