X-射線通過誘導(dǎo)TNF-α的產(chǎn)生促進(jìn)DC疫苗的抗腫瘤作用.pdf

1、目的:腫瘤DC疫苗是腫瘤免疫治療中很有前景的方法之一，但隨著對(duì)腫瘤DC疫苗研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)由于受到腫瘤微環(huán)境的影響，單純使用腫瘤DC疫苗難以獲得滿意的結(jié)果。高能X-射線在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，還可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生HMGB-1及HSP70等內(nèi)源性因子，增加腫瘤細(xì)胞的免疫原性。因此，X-射線照射可促進(jìn)腫瘤DC疫苗的抗瘤能力。但對(duì)X-射線與DC疫苗的聯(lián)合的方式以及二者聯(lián)合抗腫瘤的機(jī)制的研究還有待進(jìn)行深入研究。
　　本研究以荷瘤小鼠

2、為模型，首先觀察了X-射線照射后，腫瘤DC疫苗注射的時(shí)間窗對(duì)二者聯(lián)合抗腫瘤的影響，同時(shí)對(duì)聯(lián)合抗瘤的機(jī)制進(jìn)行了較系統(tǒng)的分析。
　　方法:
　　1、DC疫苗制備、活性及其抗原呈遞能力檢測
　　處死BALB/c小鼠，取小鼠股骨的骨髓細(xì)胞，用含有GM-CSF(10ng/ml)和IL-4(10ng/ml)的完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞分化，在培養(yǎng)的第5天，重新收集細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)至1×106/ml，重新加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入

3、X射線處理的4T1腫瘤細(xì)胞裂解液（終濃度50μg/ml），在37℃含飽和水氣、5％的CO2培養(yǎng)箱中孵育16小時(shí)，然后再用LPS（100ng/ml）和IFN-Y(10ng/ml)刺激36h進(jìn)一步誘導(dǎo)DCs的成熟，以此作為DC疫苗。
　　用終濃度25μg/ml的絲裂霉素C處理的DC細(xì)胞做為刺激細(xì)胞，反應(yīng)細(xì)胞是雌性C57BL/6小鼠的脾細(xì)胞。將反應(yīng)細(xì)胞和刺激細(xì)胞分別以200∶1、100∶1、50∶1的比例加入到96孔U型板中孵育96小時(shí)

4、，孵育完成之前的4h每孔加入20μl CellTiter96(@) AQueous One Solution Reagent。用MTS比色法來檢測反應(yīng)細(xì)胞增殖情況。
　　收集抗原負(fù)載的、LPS和IFN-Y誘導(dǎo)成熟的DCs的培養(yǎng)上清，檢測IL-12p70的水平，以了解DC分泌IL-12的情況。
　　同時(shí)收集抗原負(fù)載的、LPS和IFN-Y誘導(dǎo)成熟的DCs，流式細(xì)胞儀檢測CD11c、MHCⅡ、CD86和ICAM-1的表達(dá)。

5、　　2、X-射線對(duì)荷瘤小鼠腫瘤組織及腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)的動(dòng)態(tài)分析
　　2.1 X-射線處理荷瘤小鼠
　　將4T1細(xì)胞移植BALB/c小鼠右側(cè)第五對(duì)乳腺脂肪墊下，在腫瘤細(xì)胞移植的第七天將荷瘤小鼠隨機(jī)分為3組（8只/組）。未處理組、10Gy×3照射組（10Gy劑量照射，每日一次，連續(xù)3天）、30Gy照射組。
　　2.2 Real-time PCR動(dòng)態(tài)分析腫瘤組織及腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞IL-6、IL-10mRNA的表達(dá)

6、
　　在X-射線照射腫瘤塊后的第2、11和21天，分別處死荷瘤小鼠，分離腫瘤組織，分別提取腫瘤組織和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的總RNA，經(jīng)常規(guī)反轉(zhuǎn)錄后，用IL-6、IL-10特異性引物擴(kuò)增。
　　2.3 ELISA分析TGF-β及TNF-α的水平
　　在X-射線照射腫瘤塊后的第2、11和21天，分別處死荷瘤小鼠，分離腫瘤組織，PBS洗去血污，用含有蛋白酶抑制劑的500μl PBS進(jìn)行勻漿，12000r/min，4℃離心15mi

7、n，取上清，按照試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞因子測定。
　　3、觀察X射線聯(lián)合DC疫苗對(duì)荷瘤鼠腫瘤生長情況
　　將4T1細(xì)胞經(jīng)腹部右側(cè)第五對(duì)乳腺脂肪墊移植給BALB/c小鼠，在腫瘤細(xì)胞移植的第七天將荷瘤小鼠隨機(jī)分為6組（7只/組）。未處理組、10Gy×3照射組（10Gy劑量照射，每日一次，連續(xù)3天）、30Gy照射組、10Gy×3+DC組（最后一次照射后48h，瘤周注射106個(gè)DC細(xì)胞，一周后再注射一次DC細(xì)胞）、30Gy+DC組（照

8、射后48h，瘤周注射106個(gè)DC細(xì)胞，一周后再注射一次DC細(xì)胞）、DC組（瘤周注射106個(gè)DC細(xì)胞，一周后再注射一次）。接瘤后每天觀察腫瘤生長情況。用游標(biāo)卡尺測量腫瘤直徑，按公式（長徑×短徑2）/2計(jì)算腫瘤塊的體積(mm3)，并觀察荷瘤小鼠存活時(shí)間，繪制生存曲線。
　　4、體內(nèi)中和實(shí)驗(yàn)
　　同上述方法制備4T1荷瘤小鼠，在照射后的第3天，經(jīng)尾靜脈給荷瘤小鼠注射抗TNF-的抗體（20μg/鼠/100μl）或PBS，然后再在瘤內(nèi)

9、注射106個(gè)DC疫苗，一周后再注射一次。觀察荷瘤小鼠腫瘤的生長情況。
　　5、X-射線照射聯(lián)合DC疫苗誘導(dǎo)長效和系統(tǒng)性抗腫瘤免疫應(yīng)答的觀察
　　5.1給“治愈”的荷瘤小鼠第二次移植腫瘤
　　采用劑量為30Gy的X-射線照射聯(lián)合DC疫苗治療后（即10GyX3+DC和30Gy+DC實(shí)驗(yàn)組）,部分荷瘤小鼠存活期超過15周。將存活期超過10周且荷瘤鼠的瘤塊小于300mm3的認(rèn)為是“治愈”的荷瘤小鼠。給此小鼠第二次在左側(cè)第二對(duì)乳

10、腺脂肪墊下移植4T1細(xì)胞。對(duì)照組為第一次移植腫瘤的小鼠。
　　5.2流式細(xì)胞儀分析荷瘤小鼠脾臟淋巴細(xì)胞表達(dá)IFN-γ、CD127和CD44的CD8+T數(shù)
　　在第二次移植腫瘤的第28天，處死荷瘤小鼠，取荷瘤小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，用腫瘤抗原體外刺激24h，流式細(xì)胞儀分析表達(dá)IFN-γ、 CD127和CD44的CD8+T數(shù)。
　　5.3流式細(xì)胞儀分析腫瘤組織中CD8+T和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T-Reg)分布
　　在第二次移植腫

11、瘤的第28天，處死荷瘤小鼠，分離荷瘤小鼠的腫瘤組織并稱重。首先采用機(jī)械聯(lián)合酶解的方法得到腫瘤組織的但細(xì)胞懸液，再通過密度梯度離心的方法得到腫瘤組織浸潤的淋巴細(xì)胞。流式細(xì)胞儀分析CD4+CD25+和CD8+的T細(xì)胞，并計(jì)算CD8+T/CD4+CD25+T的比率。
　　5.4腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞CTL活性的測定
　　在第二次移植腫瘤的第28天，處死荷瘤小鼠，分離腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞，再用含有50μg/ml的4T1腫瘤細(xì)胞裂解液和10ng

12、/ml的IL-2的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7天，以此作為效應(yīng)細(xì)胞。靶細(xì)胞為培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的4T1細(xì)胞和經(jīng)射線照射的4T1細(xì)胞。CTL活性測定按照標(biāo)準(zhǔn)的比色法和試劑盒說明書進(jìn)行。
　　結(jié)果:
　　1、X射線處理的4T1細(xì)胞裂解液負(fù)載的DC表現(xiàn)高水平的抗原呈遞能力
　　為了制備高活力的DC疫苗，本實(shí)驗(yàn)首先獲得了經(jīng)X-射線照射的4T1細(xì)胞的裂解液，用這種含有腫瘤抗原的裂解液負(fù)載DC并經(jīng)LPS和IFN-Y誘導(dǎo)成熟，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析

13、可見，MHCⅡ、CD86及ICAM-1的表達(dá)與未經(jīng)X-射線照射的4T1裂解液負(fù)載的DCs沒有顯著差異;除了LPS刺激外，4T1裂解液并不能誘導(dǎo)DC產(chǎn)生IL-12。盡管如此，從Fig.1c可見，在DC與T細(xì)胞比率為50∶1的情況下，用射線照射后的4T1裂解液負(fù)載的DC疫苗比未經(jīng)照射的4T1裂解液可明顯促進(jìn)DC的抗原呈遞能力(P＜0.01)。
　　2、X-射線局部照射后提高腫瘤微環(huán)境的TNF-α水平
　　為了解局部X-射線照射對(duì)

14、腫瘤組織炎性因子表達(dá)的影響，為DC疫苗注射尋找合適的時(shí)間窗，首先利用real-time PCR動(dòng)態(tài)分析了腫瘤組織及腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的IL-10和IL-6的mRNA表達(dá);同時(shí)利用ELISA檢測了腫瘤組織中TGF-β和TNF-α的水平。Fig.3可見，在X-射線照射后的第2、11和21天，IL-10和IL-6的mRNA及TGF-β的水平均未發(fā)生明顯變化，而TNF-α的水平在照射后前2周，即第2和11天時(shí)明顯較未照射組顯著提高(P＜0.05)

15、，在照射后第21天明顯又降低。
　　3、X-射線照射可促進(jìn)DC疫苗的抗腫瘤活性
　　在4T1移植后的第7天，給予X-射線照射，然后在照射后的第3和第18天注射2次DC疫苗。從Fig.2可見，未經(jīng)處理或僅注射DC疫苗的荷瘤小鼠，在腫瘤移植的第7周全部死亡，單獨(dú)給予X-射線的荷瘤小鼠，在12周前也全部死亡。在荷瘤的第15周，X-射線照射聯(lián)合DC疫苗組的荷瘤小鼠依然有20％-50％的存活，且腫瘤塊體積均小于300mm3。
　

16、　4、TNF-α中和抗體可解除射線聯(lián)合DC疫苗對(duì)腫瘤生長的抑制
　　進(jìn)一步分析TNF-α在射線照射促進(jìn)DC疫苗抗瘤作用的機(jī)制，在荷瘤小鼠接受射線照射的第2天，經(jīng)尾靜脈注射抗TNF-α的中和抗體，結(jié)果觀察到中和抗體不僅下調(diào)了腫瘤組織中的TNF-α水平，也明顯解除了射線聯(lián)合DC疫苗對(duì)腫瘤生長的抑制（Fig.4）。
　　5、X-射線聯(lián)合DC疫苗在荷瘤小鼠建立長效和系統(tǒng)的抗腫瘤免疫
　　5.1 X-射線聯(lián)合DC疫苗“治愈”的荷

17、瘤小鼠抑制第二次移植瘤的生長
　　4T1荷瘤小鼠經(jīng)過X-射線聯(lián)合DC疫苗治療后，雖然有部分荷瘤小鼠死亡，但依然有20％-50％的荷瘤小鼠存活期超過15周（Fig.2）。由于X-射線照射后可明顯促進(jìn)TNF-α的水平，這很可能對(duì)DC疫苗誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫應(yīng)答具有促進(jìn)作用。因此，為了驗(yàn)證這一假設(shè)，給存活的荷瘤小鼠在遠(yuǎn)離“原發(fā)瘤”的左側(cè)第二對(duì)乳腺脂肪墊移植1×105個(gè)4T1細(xì)胞，對(duì)照組為第一次移植腫瘤的小鼠。由Fig.5可見，100％的對(duì)

18、照組小鼠在腫瘤移植7天后全部見到明顯的瘤塊，且在荷瘤的第6周全部死亡。而經(jīng)過聯(lián)合治療的荷瘤小鼠在重新移植腫瘤后，有60％的小鼠在第二次移植腫瘤后的第10周才觀察到新的腫瘤塊。
　　5.2 X-射線聯(lián)合DC疫苗“治愈”的荷瘤小鼠對(duì)腫瘤抗原產(chǎn)生了免疫記憶
　　為了進(jìn)一步分析荷瘤小鼠的免疫功能，在第二次荷瘤的第4周，處死部分小鼠（每組3只），分析了脾臟淋巴細(xì)胞可分泌IFN-γ的CD8+T及表達(dá)CD127的記憶性CD8+T細(xì)胞數(shù)，結(jié)

19、果聯(lián)合治療組表達(dá)CD127的記憶細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組，且產(chǎn)生IFN-γ的CD8+T細(xì)胞數(shù)也多余對(duì)照組(Fig.5C)。
　　5.3 X-射線聯(lián)合DC疫苗可提高腫瘤微環(huán)境中CD8+T/T-reg比例和腫瘤特異性CTL活性
　　X-射線聯(lián)合DC疫苗在荷瘤小鼠可建立長效和系統(tǒng)的抗腫瘤免疫，可能與腫瘤微環(huán)境中效應(yīng)T細(xì)胞的募集和CTL殺傷活性提高有關(guān)。因此，在聯(lián)合治療后的第19天，即最后一次DC疫苗注射后的第10天，分析了腫瘤組織中C

20、D8+T及T-reg細(xì)胞數(shù)，同時(shí)檢測了腫瘤組織浸潤的淋巴細(xì)胞的CTL活性。Fig.6可見，聯(lián)合治療組的腫瘤組織中CD8+T或CD8+T/T-reg比例均比對(duì)照組明顯增加;CTL活性也高于對(duì)照組。
　　結(jié)論:
　　1、X-射線照射后的前2周，腫瘤組織TNF-α水平升高，適合DC疫苗的注射;
　　2、X-射線聯(lián)合DC疫苗可誘導(dǎo)長效的抗腫瘤作用;
　　3、用抗TNF-α的中和抗體可解除X-射線聯(lián)合DC疫苗的抗腫瘤作用。