天然復(fù)雜型N-糖苷分離與糖肽的酶法合成.pdf

1、糖蛋白具有重要的生理和生化作用，但以目前的技術(shù)獲得均一糖蛋白很困難，因此對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能的研究非常緩慢。體外糖鏈人源化的改造主要是利用酶的合成活性進(jìn)行糖肽的定向合成，將完整的N-糖苷直接連到肽鏈的糖基化位點(diǎn)上。因糖苷不易以化學(xué)方法或者酶法大量合成，因此從自然界中分離天然的N-糖苷便成為獲得N-糖苷的最有效的方式。本實(shí)驗(yàn)從雞蛋蛋黃中分離到復(fù)雜型N-糖苷，并嘗試了兩種酶法合成糖肽。 雞蛋蛋黃中富含復(fù)雜型的N-唾液酸寡糖，可為糖肽的體

2、外合成提供豐富的N-糖苷來源，并且雞蛋中含有的N-糖苷與人體內(nèi)N-糖苷極其相似，因此獲得雞蛋蛋黃中的N-糖苷具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)了Akira Seko等人提出的分離方法，大大縮短了分離時(shí)間，提高了分離效率。按照Akira Seko的方法，從100個(gè)雞蛋蛋黃中分離得到糖肽SGP大約需要五個(gè)半月的時(shí)間，用改進(jìn)法1純化，大約需要四個(gè)半月的時(shí)間，而使用改進(jìn)法2大約只需兩個(gè)月的時(shí)間。從100個(gè)雞蛋中，用Akira Seko的方法大約得到24

3、0 mg SGP和12 mg寡糖苷FSG，用改進(jìn)法1大約得到300 mg SGP，15 mg FSG，用改進(jìn)法2大約得到340 mg SGP。利用改進(jìn)法2純化SGP，純化效率提高了41％，純化時(shí)間僅為原來的45％，并且節(jié)約了試驗(yàn)試劑等費(fèi)用，為大量生產(chǎn)糖苷或者糖肽奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。SG是只帶有Asn的復(fù)雜型寡糖，相比帶有6個(gè)氨基酸的SGP來說，更容易用化學(xué)法保護(hù)、修飾，保護(hù)修飾后的SG可作為底物，以固相合成法合成具有所需肽鏈序列的糖肽。1

4、mg SGP經(jīng)pronase酶切、Graphic Carbon純化后可得到0．73 mg SG，純化效率可達(dá)到80％。SG的市場(chǎng)價(jià)格大約為RMB 20000/ mg。 蛋白酶中的半胱氨酸蛋白酶在一定的條件下具有逆反應(yīng)活性，可以形成酰胺鍵合成肽鏈。基于催化中心和正反應(yīng)催化機(jī)理的相似性，本實(shí)驗(yàn)探索了來源于釀酒酵母的糖酰胺酶（Pnglp）是否具有逆反應(yīng)活性，即合成糖酰胺鍵形成糖肽。合成的促紅細(xì)胞生成素糖基化位點(diǎn)八肽（底物）在2h后開

5、始逐漸丟掉Asp的γ位羧基的保護(hù)甲基，在4h后，一半的八肽都失去了甲基。如果Asp的γ位羧基失去了保護(hù)甲基，由甲酯變成了羧基，則失去了作為Pnglp合成糖肽的底物的活性。因此，合成糖肽的反應(yīng)時(shí)間應(yīng)該少于4h。丙酮濃度大于8％時(shí)，Pnglp的酶切活性顯著降低，超過10％則失去了酶切活性，因此選用8％的丙酮作為提高反應(yīng)速率的有機(jī)溶劑。在8％丙酮存在的條件下，檢測(cè)不同時(shí)間Pnglp的酶切活性，發(fā)現(xiàn)2h之內(nèi)均有活性。綜合以上優(yōu)化條件，最終選取8

6、％丙酮和2h，作為檢測(cè)酶法合成糖肽的條件。經(jīng)LC-MS檢測(cè)，并未檢測(cè)到可利用Pnglp逆反應(yīng)合成的糖肽。 實(shí)驗(yàn)證明在大腸桿菌中重組表達(dá)來源于擬南芥的AtPnglp，該酶表現(xiàn)為轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性，而作為糖酰胺酶活性很低。Andreas Diepold等人證明AtPnglp在釀酒酵母中重組表達(dá)為糖酰胺酶活性，而不具有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性。結(jié)合上述兩種結(jié)果可以得出結(jié)論：AtPnglp在不同的微生物中重組表達(dá)，表現(xiàn)出不同的活性；在原核生物大