ICOS、BcL-6蛋白在原發(fā)性干燥綜合征外周血及唇腺組織中的表達(dá)及意義.pdf

1、干燥綜合征(sjogren's syndrome，SS)是以口眼干燥、淚液唾液分泌減少，可累及多臟器為臨床表現(xiàn)，以淋巴細(xì)胞高度浸潤為病理特點(diǎn)的彌漫性結(jié)締組織病，分為原發(fā)性和繼發(fā)性。原發(fā)性干燥綜合征(primary sjogren'ssyndrome PSS)從發(fā)病到病變遷延的基礎(chǔ)是免疫功能紊亂，外分泌腺管道上皮細(xì)胞可發(fā)揮抗原遞呈作用，細(xì)胞識(shí)別抗原后T、B細(xì)胞增殖，促使B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生大量免疫球蛋白、自身抗體，導(dǎo)致體液免疫過度

2、的異常反應(yīng)，聚集大量的各種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)造成組織損傷。
　　在此過程中有一類CD4+T細(xì)胞亞群，輔助B細(xì)胞，以趨化因子受體CXCR5為主要表面標(biāo)志物，高表達(dá)特異性ICOS、BCL-6、CD40、PD-1，分泌IL-21發(fā)揮其生物學(xué)功能，起著不可或缺的作用，這類細(xì)胞稱為濾泡輔助性T細(xì)胞(follicular helper T cell，Tfh cell)。
　　目的:目前，國內(nèi)外對Tfh細(xì)胞在SS中致病作用研究仍不是很全面

3、，本文主要是通過流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry FCM)檢測外周血CD4+CXCR5+T細(xì)胞表達(dá)率，實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)檢測外周血CXCR5、ICOS mRNA的表達(dá)量，免疫組織化學(xué)方法(Immunohistochemical IHC)檢測唇腺組織中ICOS、Bcl-6蛋白的表達(dá)情況及定位，探討Tfh細(xì)胞在干燥綜合征發(fā)病過程中其數(shù)量及生物學(xué)功能發(fā)生異常的表現(xiàn)。
　　方法:
　　1、選取河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院

4、免疫風(fēng)濕科2014年1月至2015年1月PSS患者30例作為PSS組，男性2例，女性28例，年齡范圍40～65歲之間，平均年齡(50.47±9.96)歲，其中無系統(tǒng)損害患者20例，伴肺間質(zhì)纖維化患者2例，肺動(dòng)脈高壓患者1例，免疫性血小板減少患者5例，腎小管酸中毒患者2例，入組前均未應(yīng)用激素、免疫抑制劑等藥物治療。
　　1.1流式細(xì)胞分析(FCM):30例PSS患者作為PSS組，20例健康志愿者作為健康對照組，晨起空腹采外周靜脈血1

5、ml，肝素鈉抗凝，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CXCR5+T細(xì)胞百分率，比較兩組間的差異及與臨床指標(biāo)的相關(guān)性。
　　1.2實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR):30例PSS患者作為PSS組，20例健康志愿者作為健康對照組，晨起空腹采外周靜脈血5ml，EDTA抗凝的，用Real Time PCR方法檢測PSS組和健康對照組外周血CXCR5mRNA、ICOS mRNA表達(dá)量的變化情況。通過引物設(shè)計(jì)、提取樣本總RNA、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA

6、，RT-PCR反應(yīng)體系的建立，獲得各樣本實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線圖和樣本擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線圖，計(jì)算出各樣本基因相對定量分析結(jié)果。
　　1.3免疫組織化學(xué)法(IHC):PSS患者唇腺組織為研究標(biāo)本，共30例，同時(shí)選取下唇外傷、粘膜下囊腫等非自身免疫性疾病患者20例作為對照組，所有研究對象的唇腺腺泡組織標(biāo)本均由4％多聚甲醛固定，石蠟包埋，HE染色，免疫組織化學(xué)方法檢測標(biāo)本中ICOS、Bcl-6蛋白的表達(dá)及定位，以淋巴細(xì)胞浸潤不同等級為觀察基石，顯微

7、鏡下觀察兩組間、等級間ICOS、Bcl-6蛋白的表達(dá)、定位的差異，與淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞及正常唇腺組織間的相關(guān)性，以及與生發(fā)中心的形成可能存在的聯(lián)系。
　　2、臨床指標(biāo)歸納:回顧并總結(jié)PSS患者臨床指標(biāo)，包括免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)、血沉(ESR)、抗SSA/SSB抗體等，并與本實(shí)驗(yàn)所檢測指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS21.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，一般數(shù)據(jù)資料以((x)±s)表示;兩個(gè)獨(dú)立樣本

8、比較服從正態(tài)分布，采用t檢驗(yàn)，不服從正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)（U檢驗(yàn)）;多個(gè)獨(dú)立樣本比較服從正態(tài)分布采用方差分析，不服從正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)（H檢驗(yàn)），計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)。兩變量間的相關(guān)性分析，如服從正態(tài)分布采用pearson相關(guān)系數(shù)，不服從正態(tài)分布采用spearman相關(guān)系數(shù)。以檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、FCM:PSS患者外周血中CD4+CXCR5+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞

9、百分率顯著高于正常對照組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(16.84±6.38 vs12.85±2.38，P=0.001)。PSS組外周血中CD4+CXCR5+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分率與臨床指標(biāo)血沉(ESR)、免疫球蛋白IgG、IgA、IgM均無相關(guān)性(r=-0.096，P=0.614),(r=-0.280,P=0.133),(r=-0.276,P=0.139),(r=-0.287,P=0.123)?？筍SA、抗SSB抗體陽性組與陰性組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)

10、差異(Z=-0.915，P=0.360),(Z=-1.011, P=0.312)。
　　2、RT-PCR: PSS組外周血CXCR5 mRNA表達(dá)明顯高于健康對照組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.37±0.69 vs0.57±0.12，P=0.000)。PSS組外周血ICOSmRNA表達(dá)水平與健康對照組相比上調(diào)(1.97±0.73 vs1.54±0.58，P=0.036)。PSS組外周血中CXCR5 mRNA表達(dá)高低與臨床指標(biāo)血沉ESR、免

11、疫球蛋白IgG、IgA、IgM均無相關(guān)性(r=-0.065，P=0.733)，(r=-0.051，P=0.788),(r=-0.177,P=0.350),(r=-0.259,P=0.167)。與抗SSA/SSB抗體陽性組與陰性組之間無差異(Z=0.000，P=1.000)，(Z=-1.571，P=0.116);
　　PSS組外周血中ICOS mRNA表達(dá)高低與臨床指標(biāo)血沉ESR、免疫球蛋白IgG、IgA、IgM均無相關(guān)性(r=0.

12、024，P=0.898)，(r=-0.166，P=0.382)，(r=-0.266，P=0.156)，(r=-0.394，P=0.031)，與抗SSA/SSB抗體陽性組與陰性組之間無差異(Z=-0.665，P=0.506)，(Z=-1.442，P=0.149)。
　　3、IHC: HE染色，顯微鏡下觀察PSS組和對照組唇腺組織結(jié)構(gòu)，對照組:腺泡大小分布均勻，導(dǎo)管排列整齊，間質(zhì)無或少量炎性細(xì)胞浸潤;PSS組:腺泡大小分布不等，可見部

13、分腺體萎縮，以導(dǎo)管周圍為明顯，間質(zhì)散在分布或一個(gè)多個(gè)灶性淋巴細(xì)胞浸潤;免疫組化，PSS組與對照組ICOS蛋白表達(dá)水平評分分別為3.5(2，6)分，1(0，1)分，二者差異的比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-5.54，P=0.000); PSS組組織切片中導(dǎo)管細(xì)胞及其周圍淋巴細(xì)胞均可檢測到ICOS蛋白的表達(dá)，腺泡細(xì)胞偶可檢測到陽性細(xì)胞。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析ICOS蛋白表達(dá)與導(dǎo)管周圍淋巴細(xì)胞浸潤程度呈顯著正相關(guān)(P=0.020)，說明ICOS蛋白與淋巴細(xì)胞浸

14、潤程度有關(guān);PSS組與對照組Bcl-6蛋白表達(dá)水平評分分別為6(2，6)分、0(0，1)分，二者差異的比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-5.70，P=0.000); PSS組組織切片中導(dǎo)管細(xì)胞及其周圍淋巴細(xì)胞均可檢測到Bcl-6蛋白的表達(dá)，腺泡細(xì)胞偶可檢測到陽性細(xì)胞。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Bcl-6蛋白表達(dá)與導(dǎo)管周圍淋巴細(xì)胞浸潤程度呈顯著正相關(guān)(P=0.001)，說明Bcl-6蛋白與淋巴細(xì)胞浸潤程度有關(guān)。
　　4、相關(guān)性分析:PSS組外周血CD4+C

15、XCR5+T細(xì)胞的表達(dá)與外周血CXCR5 mRNA、ICOS mRNA表達(dá)水平均存在正相關(guān)性(r=0.635，P=0.000)，(r=0.708，P=0.000); PSS組外周血CD4+CXCR5+T細(xì)胞的表達(dá)與唇腺組織中ICOS蛋白、Bcl-6蛋白表達(dá)水平均無相關(guān)性(r=0.031，P=0.871)，(r=0.006，P=0.976); PSS組外周血CXCR5 mRNA與ICOS mRNA表達(dá)水平有相關(guān)性(r=0.665，P=0.

16、000); PSS組外周血ICOS mRNA表達(dá)水平與唇腺組織中ICOS蛋白表達(dá)水平無相關(guān)性(r=-0.044，P=0.817);疾病組唇腺組織中ICOS蛋白與Bcl-6蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)性(r=0.594，P=0.001)。
　　結(jié)論:
　　1、PSS患者外周血CD4+CXCR5+Tfh樣細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例明顯升高，提示Tfh細(xì)胞可能對PSS疾病的發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用。
　　2、PSS患者外周血CXCR5、I