代謝壓力對(duì)胰島β細(xì)胞功能的影響及代償性增殖機(jī)制研究.pdf

1、研究目的和背景：
　　胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能失調(diào)是2型糖尿病發(fā)病機(jī)制中關(guān)鍵的兩大要素。代謝壓力導(dǎo)致了胰島素抵抗和β細(xì)胞功能下降。早期胰島β細(xì)胞可以通過(guò)代償性增殖，分泌更多的胰島素來(lái)維持血糖的穩(wěn)態(tài)。但隨著代謝壓力的持續(xù)進(jìn)展，胰島β細(xì)胞功能發(fā)生失代償，就會(huì)導(dǎo)致2型糖尿病的發(fā)生。因此，研究如何延緩代謝壓力下胰島β細(xì)胞功能的衰退，以及如何促進(jìn)胰島β細(xì)胞代償增殖能力來(lái)應(yīng)對(duì)增加的代謝壓力，是尋找糖尿病治療靶點(diǎn)的重要途徑。
　　過(guò)多的

2、卡路里攝入及肥胖可增加胰島β細(xì)胞的代謝壓力，損傷胰島β細(xì)胞功能，最終導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生。而卡路里限制則可以減輕代謝壓力，是預(yù)防和治療糖尿病的重要手段。但卡路里限制后對(duì)于胰島β細(xì)胞是否具有保護(hù)作用以及相關(guān)機(jī)制，現(xiàn)在還不清楚。因此我們對(duì)db/db小鼠進(jìn)行卡路里限制，以明確卡路里限制是否可以保護(hù)胰島β細(xì)胞功能并探討相關(guān)機(jī)制，為改善代謝壓力下受損的胰島β細(xì)胞功能提供新的線索。同時(shí)，胰島β細(xì)胞在代謝壓力下代償性增殖的機(jī)制目前并不十分明確，而葡萄糖是

3、代謝壓力下促進(jìn)胰島β細(xì)胞代償性增殖的重要因子，本研究中我們也對(duì)葡萄糖誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞增殖的部分機(jī)制進(jìn)行探討。在本課題組前期建立的高糖灌注誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞增殖的大鼠模型中我們發(fā)現(xiàn)，其胰島β細(xì)胞中WNT/β-catenin信號(hào)通路的抑制蛋白Sfrp5表達(dá)明顯下降。而近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)Sfrp5參與了肥胖狀態(tài)下的β細(xì)胞代償性增殖調(diào)控。Sfrp5是否也參與了高糖條件下的β細(xì)胞增殖，目前還不清楚。我們利用持續(xù)高糖灌注的大鼠模型以及胰島細(xì)胞株和分離的原代胰

4、島，對(duì)葡萄糖促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖的機(jī)制進(jìn)行探討，以期明確Sfrp5在高糖誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞增殖中的作用及其相關(guān)的調(diào)節(jié)機(jī)制，從而為2型糖尿病藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)和篩選提供新的線索和理論依據(jù)。
　　材料與方法：
　　在卡路里限制對(duì)胰島β細(xì)胞保護(hù)作用研究中，首先選取3周齡的雄性野生型C57小鼠12只，給予自由進(jìn)食，設(shè)定為wt-al組。將3周齡的雄性db/db小鼠隨機(jī)分為兩組，每組各12只。其中一組db/db小鼠參照野生型小鼠的進(jìn)食量，給予同

5、等重量的飼料，設(shè)定為db-cr組。另一組db/db小鼠自由進(jìn)食，設(shè)定為db-al組。每天監(jiān)測(cè)三組小鼠的體重、進(jìn)食量，隔天監(jiān)測(cè)隨機(jī)血糖，每周監(jiān)測(cè)一次空腹血糖，直至小鼠9周齡時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)束。在小鼠5、6、7、9周齡時(shí)行腹腔糖耐量實(shí)驗(yàn)，以觀察小鼠糖耐量水平。在小鼠9周齡實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，留取小鼠空腹血清測(cè)定血清胰島素水平，留取胰腺組織測(cè)定胰島素含量，石蠟包埋行免疫組化實(shí)驗(yàn)比較胰島形態(tài)，Ki-67免疫熒光染色比較各組小鼠的β細(xì)胞增殖情況，通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)

6、來(lái)比較各組小鼠胰島β細(xì)胞中Glut2、Pdx-1、MafA表達(dá)情況。在Sfrp5在高糖誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞增殖中的作用研究中，我們首先利用頸靜脈持續(xù)輸注50％葡萄糖24小時(shí)的方法，建立高糖誘導(dǎo)胰島增殖的大鼠模型，研究在體葡萄糖促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖時(shí)Sfrp5基因的表達(dá)情況。其次是將胰島β細(xì)胞瘤細(xì)胞系INS-1細(xì)胞和分離的大鼠原代胰島細(xì)胞，在體外用不同濃度的葡萄糖培養(yǎng)24小時(shí)，用EdU摻入的方法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。同時(shí)提取RNA和蛋白，用Real

7、time PCR和Western Blot的方法檢測(cè)Sfrp5基因的表達(dá)變化。之后通過(guò)腺病毒轉(zhuǎn)染的方法，在INS-1細(xì)胞及大鼠原代胰島細(xì)胞中高表達(dá)Sfrp5后，觀察葡萄糖刺激的胰島細(xì)胞增殖的情況。并利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)以及Western Blot的方法，檢測(cè)WNT/β-catenin信號(hào)通路的變化情況，同時(shí)檢測(cè)WNT基因下游與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因如：Cyclin D1，Cyclin D2的表達(dá)情況。最后通過(guò)在INS-1細(xì)胞中加入

8、PI3K抑制劑和轉(zhuǎn)染持續(xù)激活型AKT質(zhì)粒，研究葡萄糖調(diào)控Sfrp5表達(dá)的機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1、卡路里限制的db/db小鼠較自由進(jìn)食的db/db小鼠體重減輕，并伴隨著空腹血糖、隨機(jī)血糖、糖耐量的改善。
　　2、卡路里限制的db/db小鼠胰腺中的胰島素含量及Glut-2、Pdx-1、MafA表達(dá)水平均顯著高于自由進(jìn)食的db/db小鼠。
　　3、卡路里限制的db/db小鼠胰島β細(xì)胞Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)高于自由進(jìn)食的

9、db/db小鼠。
　　4、在高糖持續(xù)輸注24小時(shí)的大鼠模型中胰島β細(xì)胞增殖明顯，胰島中Sfrp5表達(dá)降低。
　　5、細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果提示，INS-1細(xì)胞與分離的大鼠原代胰島細(xì)胞在16.7mM的葡萄糖作用下，Edu的摻入較5.6mM的葡萄糖增高，說(shuō)明細(xì)胞增殖增加。同時(shí)Sfrp5在16.7mM葡萄糖培養(yǎng)條件下，無(wú)論mRNA或蛋白水平的表達(dá)均低于5.6mM的葡萄糖。
　　6、高表達(dá)Sfrp5的INS-1細(xì)胞和大鼠原代胰島細(xì)胞

10、進(jìn)行高糖刺激時(shí)，細(xì)胞的增殖較對(duì)照組降低，同時(shí)逆轉(zhuǎn)了高糖引起的WNT/β-catenin信號(hào)通路的激活，其下游的細(xì)胞周期蛋白Cyclin D2表達(dá)增加也被抑制。
　　7、INS-1細(xì)胞中加入PI3K抑制劑可逆轉(zhuǎn)高糖引起的Sfrp5表達(dá)下調(diào)，而AKT的持續(xù)活化可引起Sfrp5表達(dá)降低。
　　結(jié)論：
　　1、限制卡路里攝入可減輕體重，顯著減輕機(jī)體的代謝壓力，恢復(fù)與胰島β細(xì)胞功能相關(guān)的關(guān)鍵基因如Glut-2、Pdx-1、Maf