體外誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)染及向神經(jīng)上皮祖細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：糖尿病神經(jīng)源性膀胱（Diabetic Neurogenic Bladder，DNB）是糖尿病引起的泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)并發(fā)癥，因臨床治療缺乏針對(duì)性，只能暫時(shí)緩解癥狀，不能中止DNB的進(jìn)展和恢復(fù)膀胱功能。神經(jīng)生長(zhǎng)因子（Neuron Growth Factor，NGF）減少是DNB重要的致病因素。臨床試驗(yàn)證實(shí)補(bǔ)充外源性NGF可有效改善DNB，但也存在NGF半衰期短、生物利用度低等問(wèn)題。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Human Umbilical Cor

2、d Mesenchymal Stem Cells，hUCMSCs）既具有多向分化潛能，又是一種良好的基因治療的載體細(xì)胞。本課題擬在構(gòu)建含人NGF的重組慢病毒載體并轉(zhuǎn)染至人臍帶MSCs的基礎(chǔ)上，體外誘導(dǎo)分化含NGF的人臍帶MSCs成為神經(jīng)上皮祖細(xì)胞，使神經(jīng)上皮祖細(xì)胞持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)NGF，從而使NGF和誘導(dǎo)分化后的人臍帶MSCs分別發(fā)揮基因治療和細(xì)胞治療作用，為下一步的實(shí)驗(yàn)治療奠定基礎(chǔ)。
　　方法：1.從新生兒臍帶中提取hUCMSCs并

3、鑒定其基本生物學(xué)特性，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)制作生長(zhǎng)曲線、流式細(xì)胞儀鑒定hUCMSCs細(xì)胞表面抗原，免疫熒光方法驗(yàn)證hUCMSCs的Nestin蛋白表達(dá)情況。
　　2、誘導(dǎo)hUCMSCs向成骨方向及成脂方向分化。檢測(cè)膠原表達(dá)、茜素紅染色及ALP并評(píng)價(jià)成骨分化效果。油紅O染色評(píng)價(jià)成脂分化效果。從而驗(yàn)證hUCMSCs的多向分化能力。
　　3、過(guò)表達(dá)NGF的慢病毒載體構(gòu)建，篩選最佳MOI后使用慢病毒轉(zhuǎn)染hUCMSCs。熒光顯微鏡拍照，

4、估算轉(zhuǎn)染效率。
　　4、利用添加bFGF、EGF的無(wú)血清D/F12培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)兩個(gè)階段誘導(dǎo)過(guò)表達(dá)NGF的hUCMSCs向神經(jīng)上皮祖細(xì)胞分化，采用形態(tài)學(xué)觀察、免疫熒光、RT-PCR、Western-Blotting、ELISA等多種方法評(píng)價(jià)誘導(dǎo)效果。
　　結(jié)果：1、原代 hUCMSCs細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)梭形，呈漩渦狀、魚鱗樣生長(zhǎng)，倍增時(shí)間為32.1h，hUCMSCs表達(dá)間充質(zhì)表面抗原 CD105，CD29，CD13，CD90，不表達(dá)

5、CD45，CD14，CD106，CD34，HLA-DR。HLA-DR不表達(dá)證明hUCMSCs免疫原性低。
　　2、分別誘導(dǎo)分化hUCMSCs具有成骨和成脂分化潛能，證實(shí)hUCMSCs具有多向分化能力。
　　3、構(gòu)建過(guò)表達(dá)NGF的慢病毒載體并成功轉(zhuǎn)染至hUCMSCs。
　　4、經(jīng)過(guò)兩步誘導(dǎo)法，過(guò)表達(dá)NGF的hUCMSCs轉(zhuǎn)變成大量神經(jīng)樣細(xì)胞團(tuán)塊。免疫熒光染色神經(jīng)上皮祖細(xì)胞抗原標(biāo)記Nestin和Musha-1高表達(dá)，RT-

6、PCR顯示Pax-6、Masha-1、Sox-1高表達(dá)。ELISA方法檢測(cè)到培養(yǎng)液中NGF的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.證實(shí)提取的新生兒hUCMSCs具有較高的增殖能力及多向分化能力，體外培養(yǎng)多代的hUCMSCs仍然具備干細(xì)胞的基本生物學(xué)特性且免疫原性低。
　　2.成功構(gòu)建攜帶過(guò)表達(dá)NGF的慢病毒載體。
　　3.利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)成功構(gòu)建過(guò)表達(dá)NGF的hUCMSCs，并在培養(yǎng)液中得到高效穩(wěn)定的表達(dá)。
　　4．