半胱氨酰白三烯受體-2選擇性拮抗劑HAMI3379對(duì)腦缺血損傷的作用.pdf

1、背景:
　　炎癥變化是腦缺血再灌注后腦損傷的重要基礎(chǔ)之一。半胱氨酰白三烯（cysteinyl leukotrienes，CysLTs;包括LTC4、LTD4和LTE4）是一類(lèi)重要的炎癥介質(zhì)，在腦缺血、腦外傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病中起重要作用。CysLTs通過(guò)激活半胱氨酰白三烯受體(cysteinyl leukotriene receptor, CysLTR)起作用。目前，已克隆和鑒定了兩種半胱氨酰白三烯受體（即CysLT1R和C

2、ysLT2R）。
　　大鼠局灶性腦缺血后，CysLT1R表達(dá)上調(diào)，急性期表達(dá)在缺血中心區(qū)神經(jīng)元，慢性期表達(dá)在缺血中心區(qū)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞以及周邊區(qū)增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞。本課題組已經(jīng)證實(shí)CysLT1R拮抗劑普魯司特、孟魯司特對(duì)大、小鼠局灶性腦缺血模型急性和亞急性/慢性損傷均具有保護(hù)作用。該類(lèi)藥物發(fā)揮作用可能機(jī)制是抑制缺血急性期血腦屏障通透性增加并調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，減少缺血后期星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖及膠質(zhì)疤痕形成。
　　CysLT2R表達(dá)于心

3、臟、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、提睪肌脈管系統(tǒng)、腸肌層神經(jīng)元等外神經(jīng)元保護(hù)周組織細(xì)胞中;在人腦中，CysLT2R表達(dá)在血管平滑肌細(xì)胞及浸潤(rùn)的粒細(xì)胞上，而CysLT1R腦內(nèi)表達(dá)相對(duì)較少。正常大鼠腦組織中，CysLT2R主要表達(dá)于腦室周?chē)推拥男切文z質(zhì)細(xì)胞;大鼠局灶性腦缺血損傷早期CysLT2R表達(dá)于缺血中心區(qū)神經(jīng)元，后期表達(dá)于缺血中心區(qū)的小膠質(zhì)細(xì)胞以及周邊區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，同CysLT1R表達(dá)的時(shí)空特征相似。CysLT2R介導(dǎo)缺血誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞

4、的損傷;在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，CysLT2R還介導(dǎo)體外缺血損傷或LTD4處理后水通道蛋白AQP4的表達(dá);這些結(jié)果提示，CysLT2R與腦缺血損傷密切相關(guān)，抑制CysLT2R通路可能是一條治療腦缺血損傷的有效途徑。
　　HAMI3379是近年來(lái)報(bào)道的CysLT2R選擇性拮抗劑，HAMI3379對(duì)CysLT2R親和力遠(yuǎn)強(qiáng)于CysLT1R（約10000倍）。另一種CysLT2R選擇性拮抗劑Bay CysLT2可減輕小鼠心肌梗死、抑制LTD4

5、誘導(dǎo)的耳靜脈伊文思藍(lán)滲出及大鼠動(dòng)脈環(huán)微血管生成，減輕缺血性星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷。新近報(bào)道，HAMI3379雖然對(duì)皮層神經(jīng)元OGD/R誘導(dǎo)的損傷無(wú)明顯作用，但可抑制皮層細(xì)胞混合培養(yǎng)體系中細(xì)胞活性下降及LDH釋放，并通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活，減少神經(jīng)元死亡，但是，HAMI3379在整體水平上，對(duì)大鼠局灶性腦缺血損傷是否有保護(hù)作用還需進(jìn)一步研究。
　　已經(jīng)證實(shí)CysLT2R可通過(guò)激活小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)缺血性神經(jīng)元損傷。BV2細(xì)胞是小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞株

6、，具有原代小膠質(zhì)細(xì)胞的特性，已被廣泛用于相關(guān)研究。那么CysLT2R拮抗劑HAMI3379及CysLT1R拮抗劑普魯司特，對(duì)OGD誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞激活是否有類(lèi)似的保護(hù)作用，其有關(guān)的作用機(jī)制是什么？都有待于進(jìn)一步研究。
　　目的:
　　本研究采用大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)誘導(dǎo)的局灶性腦缺血再灌注模型，及缺氧缺糖(OGD)激活BV2細(xì)胞模型，研究CysLT2R選擇性拮抗劑HAMI3379對(duì)大鼠局灶性腦缺血的治療作用，并闡明對(duì)

7、HAMI3379對(duì)OGD誘導(dǎo)改變的BV2細(xì)胞激活作用及有關(guān)作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)主要分以下2個(gè)方面:
　　(1)首先，以側(cè)腦室注射為給藥途徑，初步觀察HAMI3379對(duì)大鼠局灶性腦缺血急性損傷的保護(hù)作用，并與CysLT1R拮抗劑普魯司特比較。其次，用更接近臨床的給藥方法，進(jìn)一步明確腹腔注射HAMI3379對(duì)大鼠局灶性腦缺血急性及慢性損傷的保護(hù)作用。
　　(2)研究HAMI3379及普魯司特對(duì)OGD誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞激活、細(xì)胞因子、自噬

8、及受體間相互作用的影響。
　　方法:
　　用線栓法阻塞大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈(MCAO)，制備局灶性腦缺血模型;以神經(jīng)癥狀評(píng)分和斜板實(shí)驗(yàn)觀察動(dòng)物神經(jīng)功能損傷;用激光多普勒血流儀檢測(cè)局部腦血流;以TTC染色法檢測(cè)腦損傷面積及腦水腫;以甲苯胺藍(lán)或尼氏染色觀察神經(jīng)元形態(tài)，以Fluoro-Jade B染色法觀察變性神經(jīng)元;以免疫組織化學(xué)法觀察血腦屏障通透性的變化、小膠質(zhì)細(xì)胞、激活的小膠質(zhì)細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化;以免疫熒光組

9、織化學(xué)法觀察存活神經(jīng)元、以CBA法檢測(cè)大鼠血清及腦脊液中IFN-γ，IL-4，IL-10含量，以ELISA法檢測(cè)大鼠鼠血清及腦脊液中IL-1β、IL-6、TNF-α含量。
　　在離體實(shí)驗(yàn)中，MTT還原試驗(yàn)和LDH釋放試驗(yàn)觀察不同OGD時(shí)間及恢復(fù)時(shí)間對(duì)BV2存活的影響，確定誘導(dǎo)BV2細(xì)胞激活及損傷的OGD/R條件。免疫熒光共染法確定CysLT1R和CysLT2R表達(dá)，觀察自噬的變化，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BV2熒光微珠吞噬的吞噬功能，用流

10、式細(xì)胞儀及AnnexinⅤ/PI試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，用PLA法確定CysLT1R-CysLT2R相互作用。用CBA法測(cè)定BV2細(xì)胞的上清液中TNF、IL-6的釋放。用Real-time PCR法測(cè)定BV2細(xì)胞中IL-2、IL-6、IL-17α、IL-10、EGR-2、IL-4、TNF和IFN-γ等細(xì)胞因子的變化。
　　結(jié)果:
　　第一部分 HAMI3379對(duì)大鼠局灶性腦缺血的治療作用HAMI3379側(cè)腦室術(shù)前給藥(10

11、0ng)對(duì)MCAO大鼠血糖、平均動(dòng)脈壓、二氧化碳分壓、血氧分壓，血糖、pH值及血流變化模式無(wú)影響。缺血再灌注24h后，HAMI3379(10，100 ng)能顯著地減少神經(jīng)癥狀評(píng)分，提高斜板角度，減少梗死體積，減輕腦水腫，抑制神經(jīng)元的丟失，壞死及缺血側(cè)半球皮層及紋狀體梗死區(qū)IgG滲出，該作用與普魯司特相似。CysLT2R shRNA側(cè)腦室注射可明顯減少大鼠局灶性腦缺血/再灌注24 h腦梗死體積及腦水腫，這些結(jié)果證明，HAMI3379對(duì)大

12、鼠局灶性腦缺血的急性損傷具有保護(hù)作用并且是CysLT2R依賴(lài)的。
　　HAMI3379腹腔注射給藥（0.1mg/kg）對(duì)MCAO大鼠平均動(dòng)脈壓、血糖等生理指標(biāo)無(wú)影響。各組間死亡率無(wú)顯著差異。HAMI3379對(duì)大鼠局灶性腦缺血急性期損傷的保護(hù)作用具有劑量及時(shí)間依賴(lài)性。HAMI3379腹腔注射的有效劑量0.1～0.4mg/kg，HAMI3379腹腔注射的作用時(shí)間窗是1h。HAMI3379對(duì)大鼠缺血再灌注24，72h的損傷均具有改善作用

13、，即可減少神經(jīng)功能損傷、減輕腦梗死、腦水腫及缺血側(cè)神經(jīng)元丟失與壞死。HAMI3379可減少M(fèi)CAO術(shù)后24h的血清、腦脊液中IL-1β、IFN-γ、TNF-α釋放。HAMI3379還可抑制MCAO術(shù)后72h缺血側(cè)半球MPO浸潤(rùn)，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活，但對(duì)該時(shí)間點(diǎn)星形膠質(zhì)細(xì)胞增生無(wú)明顯抑制作用。與HAMI3379比較，CysLT1R拮抗劑普魯司特對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活及IFN-γ釋放無(wú)作用，但可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生，減少血清中IL-4的釋放。

14、上述結(jié)果表明，腹腔注射HAMI3379對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后24～72h損傷具有保護(hù)作用，并且，可以減少小膠質(zhì)細(xì)胞有關(guān)的炎癥，進(jìn)一步證實(shí)CysLT2R可作為腦缺血治療的新靶點(diǎn)。
　　HAMI3379(0.1mg/kg, i.p.)術(shù)后連續(xù)給藥6d，與普魯司特作用相似，能顯著減少大鼠MCAO術(shù)后0～7d的神經(jīng)癥狀評(píng)分，提高斜板角度，減輕大鼠MCAO術(shù)后14d的腦萎縮，減少缺血周邊區(qū)的神經(jīng)元丟失，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生

15、。以上結(jié)果提示HAMI3379對(duì)大鼠局灶性腦缺血慢性損傷也有保護(hù)作用。
　　第二部分 HAMI3379對(duì)OGD誘導(dǎo)BV2細(xì)胞激活的影響OGD1 h后恢復(fù)(R)48h，可誘導(dǎo)BV2細(xì)胞適度激活，細(xì)胞激活后形態(tài)發(fā)生明顯變化、炎癥因子合成及釋放增加，吞噬功能、細(xì)胞自噬增強(qiáng)，細(xì)胞的CysLT1R和CysLT2R表達(dá)上調(diào)，并發(fā)生核移位，且兩者表達(dá)在時(shí)空分布變化上具有一致性。HAMI3379可逆轉(zhuǎn)OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞激活，減少炎癥因子的合成和

16、釋放，抑制吞噬功能和細(xì)胞自噬增強(qiáng)，抑制CysLT1R和CysLT2R表達(dá)上調(diào)和核移位。普魯司特與HAMI3379作用相似，但對(duì)吞噬功能無(wú)影響。PLA試驗(yàn)證明CysLT1R-CysLT2R間存在相互作用，OGD1h/R48h可增強(qiáng)這種相互作用;HAMI3379可抑制CysLT1R-CysLT2R相互作用，并能增加CysLT1R mRNA表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　(1)在大鼠局灶性腦缺血模型，側(cè)腦室給藥初步證實(shí)HAMI3379對(duì)急

17、性損傷的保護(hù)作用;腹腔注射給藥對(duì)急性、亞急性損傷有保護(hù)作用，并可減輕炎癥反應(yīng)，尤其能較強(qiáng)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活，其有效劑量是0.1～0.4mg/kg，治療時(shí)間窗為術(shù)后1h;對(duì)腦缺血慢性損傷亦有保護(hù)作用，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。其作用與CysLT1R拮抗劑普魯司特相似，但也有不同特點(diǎn)。
　　(2)在小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株BV2細(xì)胞，HAMI3379可抑制OGD/R誘導(dǎo)BV2細(xì)胞適度激活后的炎癥因子合成及釋放的增加以及吞噬功能、細(xì)胞自噬的增強(qiáng)。普魯司