血清刺激PI3K-AKT通路調(diào)控核仁轉(zhuǎn)錄及UBF1磷酸化.pdf

1、目的：
　　初步探討PI3K/AKT通路在血清刺激宮頸痛HeLa細胞UBF1磷酸化及核仁轉(zhuǎn)錄中的調(diào)控作用。
　　方法：
　　通過Realtime PCR技術(shù)和Western Blot技術(shù)分別檢測血清刺激和血清饑餓對細胞的核仁轉(zhuǎn)錄狀態(tài)及UBF S388磷酸化、PI3K/AKT通路活化的影響;再分別用PI3K抑制劑及AKT抑制劑處理血清刺激的細胞以阻斷相應(yīng)通路，借助Realtime PCR技術(shù)、Western Blot技術(shù)

2、和Luciferase Assay技術(shù)觀察PI3K/AKT通路對血清刺激后的核仁轉(zhuǎn)錄、UBF S388磷酸化、核糖體基因(rDNA)啟動子活性的影響;隨后通過Western Blot實驗和Luciferase Assay實驗來比較PI3Kα抑制劑、PI3Kβ抑制劑及LY294002對HeLa細胞內(nèi)PI3K/AKT通路的阻斷作用、UBF S388磷酸化狀態(tài)及rDNA啟動子活性的影響。最后通過Western Blot技術(shù)和PI染色流式細胞術(shù)

3、檢測PI3K通路和Akt通路各自對下游mTORC1通路活化、周期蛋白cyclinE和cyclinA的蛋白水平及細胞周期的影響是否存在差異。
　　結(jié)果：
　　血清饑餓時，Pre-RNA合成量隨著饑餓時間的延長而減少。UBF及P-UBF(S388)在饑餓24h時呈小幅度減少，且后者較前者減少更明顯;超過24h二者又逐漸增加。AKT總量不變，P-AKT隨時間減少;血清刺激后Pre-RNA合成量隨著時間延長而增加。UBF的總量幾乎無

4、變化，P-UBF(S388)蛋白量則隨著刺激時間延長而逐漸增加。AKT總量不變，P-AKT刺激后快速增加，維持至6h后又減少。
　　PI3K抑制劑LY294002處理組和AKT抑制劑處理組中，Pre-RNA合成量隨時間延長不斷減少，前者減少得更多。兩種處理組Pre-RNA的減少在12h時有統(tǒng)計學(xué)意義差異;AKT總蛋白水平無明顯變化，P-AKT蛋白在兩種抑制劑作用時均逐漸減少，直至檢測不到，且P AKT在LY294002處理組比AK

5、T抑制劑處理組減少得更快;UBF和P-UBF在通路阻斷后均減少，以LY294002處理組更顯著。
　　PI3Kα抑制劑處理6h使UBF及P-UBF(S388)在大幅度減少，AKT及P-AKT(S473)亦呈時間梯度減少;而PI3Kβ抑制劑處理組時UBF及P UBF(S388)無明顯減少，但AKT及P-AKT(S473)呈減少趨勢;PI3KⅡ抑制劑、LY294002及AKT抑制劑均使啟動子活性減少，以PI3Kα抑制劑組減少得最多，L

6、Y294002次之。AKT抑制劑組分別于PI3Kα抑制劑組、LY294002組進行組間比較，P值均小于0.05。PI3Kα抑制劑組與LY294002組比較得P值為0.772。
　　阻斷PI3K通路后P-mTOR(S2448)顯著減少，cyclinE蛋白量亦減少但cyclinA并未減少，HeLa細胞被停滯在S期;但阻斷AKT通路后，P-mTOR(S2448)及周期蛋白cyclinE和cyclinA的蛋白總量均無明顯變化，細胞被停滯在

7、G2/M期。
　　結(jié)論：
　　血清刺激HeLa細胞使其核仁轉(zhuǎn)錄增加，伴PI3K/AKT通路激活和UBF活化;血清饑餓則呈時間梯度式抑制核仁轉(zhuǎn)錄、PI3K通路及UBF活化。PI3K/AKT通路，至少通過促進UBFS388磷酸化及提高rDNA啟動子活性調(diào)控血清刺激后的核仁轉(zhuǎn)錄;在所有的PI3K激酶亞型中，ⅠA型PI3K在HeLa細胞中起主要作用。PI3K通路和AKT通路對血清刺激的UBF磷酸化及核仁轉(zhuǎn)錄的調(diào)控存在差異。血清刺激信