清熱活血方抗類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜血管新生相關(guān)因子的研究.pdf

1、目的:
　　觀察清熱活血方對膠原誘導性關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠關(guān)節(jié)滑膜血管新生的影響，及體外對類風濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞(RA-FLS)和臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)增殖、遷移、黏附和管腔形成的影響，并通過PI3K/Akt通路探索相關(guān)作用機制，為清熱活血方在臨床治療類風濕關(guān)節(jié)炎提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　將健康雌性SD大鼠稱重后隨機分為6組:正常組，模型組，清熱活血方低、中、高組（15、20、25g生藥/kg），抑制

2、劑LY294002組(20mg/kg),采用Ⅱ型膠原乳化劑在大鼠尾根部皮下注射，在第7天于相同部位注射等量Ⅱ型膠原乳化劑以加強免疫，建立CIA模型。免疫第10天開始灌胃給藥，正常組和模型組予等量生理鹽水。連續(xù)給藥28天，并在過程中觀察并記錄各組大鼠體重變化、關(guān)節(jié)癥狀和腫脹度;各組大鼠腹主動脈取血于離心管，離心收集血清，用ELISA法測定各組大鼠血清中促炎癥因子白介素-1β(IL-1β)和促血管新生血管生長因子(VEGF)的表達;West

3、ern Blot法檢測踩關(guān)節(jié)組織中PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路相關(guān)蛋白PI3K、p-Akt、PTEN的表達;Real-time PCR檢測滑膜組織中胎盤生長因子(PLGF)及其受體Flt1、Flk1和PI3K/Akt通路負調(diào)控基因PTEN的mRNA水平表達。
　　取RA患者膝關(guān)節(jié)滑膜組織，采用組織貼壁法分離人類原代RA-FLS，傳代培養(yǎng)，第3～6代細胞用于實驗;同時培養(yǎng)HUVEC進行實驗。清熱活血方低、中、高濃度(20、100、5

4、00ng生藥/mL)與TNF-α誘導的RA-FLS和VEGF165誘導的HUVEC共孵育，并設(shè)置空白對照組，采用MTS法檢測細胞增殖活性;通過劃痕實驗觀察細胞的遷移作用;用細胞外基質(zhì)的主要成分之一纖連蛋白(FN)包被培養(yǎng)板，觀察細胞對FN黏附的變化;采用基質(zhì)膠包被培養(yǎng)板，觀察HUVEC的管腔形成能力;ELISA法測定RA-FLS分泌的IL-1β、VEGF、PLGF及其受體Flt1、Flk1的表達;Western Blot檢測PI3K/A

5、kt通路相關(guān)蛋白水平的表達。
　　結(jié)果:
　　1.清熱活血方對CIA大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀、關(guān)節(jié)腫脹度和體重的影響
　　模型組與正常組相比，大鼠關(guān)節(jié)紅腫明顯，后足腫脹度顯著增加(P＜0.001)，與模型組相比，清熱活血方可呈劑量依賴性減輕關(guān)節(jié)紅腫的癥狀，且中、高劑量(20、25g/kg)可顯著降低關(guān)節(jié)腫脹度（P＜0.05），LY294002亦可明顯緩解后足腫脹度（P＜0.05）。
　　與正常組相比，模型組體重增長緩慢，清

6、熱活血方與模型組相比，能呈劑量依賴性地促進CIA大鼠體重的增加，高劑量(25g/kg)組與LY294002組在免疫第21天起體重增加明顯（P＜0.05）。
　　2.清熱活血方對CIA大鼠血清IL-1β、VEGF表達的影響
　　給藥28天后，與正常組相比，模型組血清IL-1β、VEGF的含量顯著升高(P＜0.01)，與模型組相比，清熱活血方可不同程度地降低IL-1β、VEGF的含量，呈劑量相關(guān)性，高劑量(25g/kg)能明顯降

7、低IL-1β、VEGF的含量(P＜0.05)，LY294002組IL-1β明顯下降(P＜0.05)。
　　3.清熱活血方對CIA大鼠踝關(guān)節(jié)組織中PI3K/Akt通路蛋白表達的影響
　　給藥28天后，模型組相較正常組，組織中PI3K蛋白表達和Akt磷酸化水平顯著升高（P＜0.001），清熱活血方治療后可呈劑量依賴性下調(diào)PI3K、p-Akt蛋白的表達（P＜0.01，P＜0.001）。模型組的PTEN蛋白表達較正常組顯著下調(diào)（P＜

8、0.001），清熱活血方中、高劑量(20、25g/kg)能明顯上調(diào)PTEN的表達(P＜0.05，P＜0.001)，LY294002能顯著抑制PI3K、p-Akt并促進PTEN的表達(P＜0.001)。
　　4.清熱活血方對CIA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中PLGF、Flt1、Flk1及PTEN mRNA表達的影響
　　給藥28天后，模型組的PLGF、Flk1、Flt1 mRNA的表達水平較正常組顯著升高(P＜0.01)，與模型組相比

9、，清熱活血方20、25g/kg給藥劑量處可明顯下調(diào)表達水平（P＜0.05，P＜0.01）。與正常組相比，模型組PTENmRNA的表達顯著降低(P＜0.001)，清熱活血方25g/kg能顯著升高PTEN mRNA表達(P＜0.001)。LY294002均能顯著下調(diào)PLGF、Flk1、Flt1，上調(diào)PTENmRNA水平的表達(P＜0.01，P＜0.001)。
　　5.清熱活血方對RA-FLS和HUVEC增殖活性的影響
　　與空白

10、對照組比較，TNF-α可明顯提高RA-FLS的增殖活性(P＜0.05)，清熱活血方可呈濃度依賴性抑制RA-FLS增殖，在2.5、12.5μg/mL有顯著性差異（P＜0.05），與空白對照組相比，VEGF誘導能明顯促進HUVEC增殖(P＜0.05)，清熱活血方可抑制HUVEC的增殖活性，在12.5μg/mL濃度處差異有顯著性（P＜0.05）。
　　6.清熱活血方對RA-FLS和HUVEC遷移的影響
　　RA-FLS劃痕后24h

11、與0h相比，空白對照組劃痕區(qū)域可見少量細胞生長，TNF-α誘導促進RA-FLS遷移作用增強(P＜0.001);與TNF-α組比較，清熱活血方能減弱顯著RA-FLS向劃痕區(qū)域遷移（P＜0.01，P＜0.001），并且呈現(xiàn)量效相關(guān)性。HUVEC劃痕后24h與0h相比，空白對照組有少量細胞向劃痕區(qū)域遷移，VEGF誘導促進HUVEC遷移作用顯著增強(P＜0.001)，清熱活血方處理與VEGF組相比，可呈劑量依賴性抑制HUVEC向劃痕區(qū)域遷移(P

12、＜0.001)。
　　7.清熱活血方對RA-FLS和HUVEC黏附的影響
　　與1％BSA陰性對照相比，RA-FLS對FN有較強的黏附能力(P＜0.001)，TNF-α誘導可顯著增加RA-FLS對FN的黏附(P＜0.001);清熱活血方可呈劑量依賴地抑制其黏附能力(P＜0.001)。HUVEC與陰性對照相比，對FN黏附能力較強(P＜0.001)，VEGF誘導能顯著促進HUVEC對FN的黏附（P＜0.001）;清熱活血肪能抑制

13、其黏附作用(P＜0.001)，并呈劑量相關(guān)性。
　　8.清熱活血方對HUVEC管腔形成的影響
　　與空白對照組相比，VEGF誘導能明顯促進HUVEC在基質(zhì)膠上形成管腔的能力(P＜0.001)，清熱活血方隨濃度的增大可顯著抑制HUVEC的管腔形成(P＜0.05，P＜0.001)，并呈劑量依賴性。
　　9.清熱活血方對RA-FLS和HUVEC中血管新生相關(guān)因子含量的影響
　　與空白對照組相比，TNF-α誘導可顯著增加

14、RA-FLS培養(yǎng)上清中IL-1β、VEGF、PLGF的含量(P＜0.01)，清熱活血方500ng/mL組可明顯降低上清中IL-1β、PLGF的含量（P＜0.05），在100、500ng/mL濃度組能顯著減少VEGF的含量(P＜0.05，P＜0.01)。VEGF誘導能顯著促進HUVEC中VEGFR1、VEGFR2的含量增加(P＜0.01)，清熱活血方100ng/mL可明顯降低其含量(P＜0.05)。
　　10.清熱活血方對RA-FL

15、S和HUVEC中PI3K/Akt通路蛋白表達的影響
　　與空白對照組相比，TNF-α可顯著促進RA-FLS中PI3K蛋白的表達和Akt的磷酸化(P＜0.001)，清熱活血方能呈劑量依賴性降低PI3K、p-Akt的表達(P＜0.001)，加入LY294002亦能顯著抑制TNF-α誘導的RA-FLS中PI3K、p-Akt表達。同時，VEGF誘導相比于空白對照組，PI3K、p-Akt的蛋白表達明顯升高，(P＜0.001)，清熱活血方能不

16、同程度地抑制其表達(P＜0.001)，LY294002亦可顯著抑制VEGF誘導HUVEC中PI3K、p-Akt的蛋白表達水平升高。
　　結(jié)論:
　　1.清熱活血方灌胃治療可減輕CIA大鼠關(guān)節(jié)紅腫癥狀，降低關(guān)節(jié)腫脹度，并能劑量依賴性地降低血清中促炎因子IL-1β和促血管新生因子VEGF的含量，下調(diào)滑膜組織中PLGF、Flt1、Flk1mRNA的表達水平，從而改善CIA大鼠臨床癥狀、減輕滑膜炎癥、抑制新生血管的形成，延緩關(guān)節(jié)炎的

17、進展。
　　2.清熱活血方能顯著抑制RA-FLS的增殖、遷移、黏附以及促炎因子IL-1β和促血管生長因子VEGF、PLGF的含量，與對HUVEC增殖、遷移、黏附、管腔形成及Flt1、Flk1含量的抑制協(xié)同作用，抑制血管新生的發(fā)生。
　　3.清熱活血方可呈劑量依賴地下調(diào)CIA大鼠及RA-FLS和HUVEC細胞中PI3K、p-Akt蛋白的表達，上調(diào)CIA大鼠負調(diào)控基因PTEN的蛋白和mRNA水平的表達，提示清熱活血方可能通過PI