鈦表面HA-CS-TGF-β1緩釋微球復(fù)合涂層及其對(duì)成骨細(xì)胞粘附與增殖的影響.pdf

1、目的:本實(shí)驗(yàn)擬采用物理-生物-化學(xué)聯(lián)合的方式，研究于純鈦表面制備HA/CS-TGF-β1緩釋微球復(fù)合涂層的方法，使鈦經(jīng)表面改性后能具有有利于骨結(jié)合的理化形貌以及生化修飾，使之獲得相應(yīng)的生物功能。探討HA/CS-TGF-β1緩釋微球復(fù)合涂層對(duì)大鼠成骨細(xì)胞早期粘附與增殖的作用，評(píng)價(jià)其細(xì)胞毒性及其對(duì)鈦表面成骨細(xì)胞特征基因表達(dá)的影響，以此為利用表面改性來(lái)提高口腔種植體的生物功能和早期骨結(jié)合提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為促進(jìn)HA/CS-TGF-β1緩

2、釋微球復(fù)合涂層種植體的臨床運(yùn)用進(jìn)行一定的實(shí)驗(yàn)探索。
　　方法:通過(guò)物理-化學(xué)-生物改性聯(lián)合的方式來(lái)制備HA/CS-TGF-β1緩釋微球涂復(fù)合涂層。將10mm*10mm*1 mm鈦片打磨清洗并進(jìn)行表面微弧氧化處理后放入多巴胺溶液浸泡18h，干燥。將已溶解的HA緩慢滴入CS凝膠，攪拌溶解1.5h，在經(jīng)上述步驟處理的干燥鈦片表面滴加該溶液，負(fù)壓處理10min，干燥24h。將經(jīng)微弧氧化步驟處理的鈦片共100片平均分成A、B、C、D、E組，

3、每組20片，為實(shí)驗(yàn)組。另備20片只經(jīng)打磨處理的鈦片為對(duì)照F組，備5只編號(hào)分別為A、B、C、D、E的裝有20ml0.1g/ml CS凝膠的燒杯，各加入0.4g明膠微球，攪拌20min后放入對(duì)應(yīng)的鈦片各20片，冰浴下各加入0.08gEDC溶解后加入0.12gNHS，隨后立刻加TGF-β1蛋白，加入蛋白濃度分別為A組15ng/ml、B組30ng/ml/、C組60ng/ml/、D組75n/ml、E組250ng/ml。交聯(lián)反應(yīng)12h，干燥。以SE

4、M、XRD、FT-IR分別檢測(cè)HA/CS-TGF-β1緩釋微球復(fù)合涂層的理化結(jié)構(gòu)、生化組成并檢測(cè)其親水性，釋藥量。
　　采用CCK-8法，取雙抗滅菌后各組鈦片各5片平鋪于48孔培養(yǎng)板。分離大鼠成骨細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，將傳代培養(yǎng)后的P2代細(xì)胞懸液按100μl/孔的濃度接種于各組，置于37℃、5％C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng);于實(shí)驗(yàn)的1、3、7d分別將培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，每孔加CCK-8試劑溶液20ul，37℃下孵育2.5 h

5、后每孔取110ul液體到96孔板內(nèi)，使用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為450 nm的條件下檢測(cè)各孔OD值。將成骨細(xì)胞按1*103/孔細(xì)胞密度接種于各組材料表面，每孔100μ l細(xì)胞懸液，于6h和3天后分別對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行DAPI染色，將染色后的細(xì)胞置于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的增殖情況。
　　將大鼠成骨細(xì)胞在復(fù)合涂層的鈦片上培養(yǎng)1d，2d，3d，5d，7d后取樣，對(duì)大鼠成骨細(xì)胞mRNA進(jìn)行提取，轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增。分別取10μL成骨細(xì)胞特征基因ALP，Run

6、x2，TGF-β1的PCR反應(yīng)產(chǎn)物，在2.0％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳得出成骨標(biāo)志性基因ALP，Runx2，TGF-β1的條帶。
　　結(jié)果:成功制備HA/CS-TGF-β1緩釋微球復(fù)合涂層，掃描電子顯微鏡(SEM)見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組鈦片表面存在形狀較為規(guī)則的、其大小和間距基本相同的小微孔，載TGF-β1蛋白的明膠微球形狀為圓球型，粒徑較為均勻，表面可見(jiàn)蛋白吸附。XRD圖譜可以看到當(dāng)鈦表面制備HA/CS-TGF-β1緩釋微球復(fù)合涂層后，基體鈦峰

7、幾乎被湮沒(méi)，2θ=31.7°，這與HA標(biāo)準(zhǔn)粉末衍射數(shù)據(jù)譜峰的(211)晶面的特征峰位置吻和。復(fù)合涂層制備完成后接觸角幾乎為零，即該復(fù)合涂層具有超親水性。HA-CS-TGF-β1體外釋藥情況:在釋藥初期HA/CS-TGF-β1復(fù)合涂層存在“突釋”效應(yīng)，而后蛋白的釋放逐漸平緩，至蛋白釋放第7d釋放達(dá)(58.4±1.8)％，14d時(shí)TGF-β1蛋白釋放濃度達(dá)(80.1±1.9)％。
　　將各組鈦片與細(xì)胞分別培養(yǎng)1d，3d，7d后，實(shí)驗(yàn)結(jié)

8、果發(fā)現(xiàn)在1d時(shí)各組之間的差異不明顯(P＞0.05)，隨著對(duì)大鼠成骨細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的增加，在第3天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的大鼠成骨細(xì)胞的數(shù)量均有較為明顯增長(zhǎng)且實(shí)驗(yàn)組大鼠成骨細(xì)胞密度大于對(duì)照組的大鼠成骨細(xì)胞密度(P＜0.05)，B、C兩實(shí)驗(yàn)組的大鼠成骨細(xì)胞增殖數(shù)目大于其他各組。第7天，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖情況明顯優(yōu)于對(duì)照組(P＜0.05)，B、C組細(xì)胞增殖明顯大于其他組(P＜0.05)，E組大鼠成骨細(xì)胞密度小于其他實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)。大鼠成骨細(xì)胞于

9、復(fù)合涂層的鈦片上生長(zhǎng)無(wú)抑制，表明該涂層無(wú)細(xì)胞毒性。大鼠成骨細(xì)胞接種于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組鈦片，孵育6h及3d之后，經(jīng)DAPI對(duì)成骨細(xì)胞胞核染色后，發(fā)現(xiàn):接種6h，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的鈦片表面的大鼠成骨細(xì)胞數(shù)量并無(wú)明顯差距;而在3d，各組均有明顯增殖，特別是實(shí)驗(yàn)B、C組尤其明顯，E組的細(xì)胞數(shù)量少于其他實(shí)驗(yàn)組的大鼠成骨細(xì)胞數(shù)量，所有實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞數(shù)量明顯比對(duì)照組多，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了復(fù)合涂層可促進(jìn)成骨細(xì)胞的粘附與早期增殖。
　　在一定TGF-β1濃度

10、下鈦表面成骨細(xì)胞的ALP，Runx2基因表達(dá)量將隨著時(shí)間增加，B、C兩組尤為明顯，而TGF-β1的表達(dá)量基本不變。
　　結(jié)論:
　　(1) HA/CS-TGF-β1緩釋微球復(fù)合涂層釋藥穩(wěn)定且維持時(shí)間長(zhǎng)，能較長(zhǎng)時(shí)間的為組織提供TGF-β1。
　　(2) HA/CS-TGF-β1緩釋微球復(fù)合涂層完成后接觸角幾乎為零，即具有超親水性。由細(xì)胞的粘附與增殖實(shí)驗(yàn)可以看出，親水性的樣品表面確實(shí)對(duì)相應(yīng)的細(xì)胞的粘附與增殖有促進(jìn)作用。