材料表面吸附蛋白對成骨細(xì)胞的影響.pdf

1、生物材料和組織工程支架材料在用于醫(yī)療修復(fù)或器官替代中需要其具有良好的生物相容性。材料的生物相容性體現(xiàn)在材料表面與吸附于其上的蛋白的相互作用。材料表面吸附蛋白的種類、數(shù)量和構(gòu)象變化都對后期的細(xì)胞粘附和組織形成起了一定的介導(dǎo)作用。本文運用金-硫醇自組裝單分子層（Self-AssembledMonolayer,簡稱SAM)技術(shù)，構(gòu)建了不同化學(xué)基團(tuán)（-NH2、-COOH、-OH和-CH3）修飾的材料表面。采用X射線光能質(zhì)譜（XPS）表征了材料表

2、面化學(xué)組成，靜態(tài)水接觸角測定材料表面的親/疏水性。運用BCA蛋白定量測定技術(shù)和免疫組化法測定了預(yù)吸附于SAM表面上纖連蛋白的吸附量和構(gòu)象。采用體外細(xì)胞培養(yǎng)法，以SD大鼠顱骨成骨細(xì)胞為模型細(xì)胞，以聚苯乙烯（TCPS）和純金表面為對照，將細(xì)胞與各SAMs表面復(fù)合培養(yǎng)，從細(xì)胞增殖、分化與礦化能力等方面考查了經(jīng)過蛋白質(zhì)處理過后的SAM表面與成骨細(xì)胞的細(xì)胞相容性；同時，考查了SAM表面對成骨細(xì)胞整合素-細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的影響，從而更綜合的評價了材

3、料表面吸附蛋白對后期的細(xì)胞粘附和增殖形成的一定的介導(dǎo)作用。主要工作和結(jié)論如下：
　　(1)不同化學(xué)基團(tuán)SAM表面的制備及表面化學(xué)組分和親/疏水性測定：通過金-硫醇自組裝單分子層技術(shù)制備了四種不同化學(xué)基團(tuán)的SAM表面，即-CH3、-OH、-COOH、-NH2。XPS技術(shù)定性檢測了材料表面化學(xué)組分。采用靜態(tài)水接觸角評價了材料的親/疏水性能。結(jié)果表明，-OH與-COOH為親水性表面，分別為17°和25°，-NH2為中性表面，水接觸角為4

4、9°，-CH3為強疏水性表面，為105°。
　　(2)SAM表面對纖連蛋白的吸附量和吸附構(gòu)象的影響：采用BCA蛋白定量法分別測定了不同濃度下，纖連蛋白在不同表面化學(xué)性質(zhì)材料上的吸附量。結(jié)果表明，纖連蛋白在25μg/mL的濃度下，-OH表面上為113ng/cm2，單位面積上吸附的蛋白質(zhì)量最低；-NH2與-CH3表面分別達(dá)到了437ng/cm2與349ng/cm2；-COOH表面為264ng/cm2、TCPS表面為386ng/cm2、

5、Au表面為209ng/cm2。FN為40ng/cm2時，親水性表面-OH對FN構(gòu)象變化影響較其他表面低，強疏水性表面-CH3對FN構(gòu)象變化影響最大。
　　(3)成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定：采用組織塊法培養(yǎng)出生1-3天的SD大鼠顱骨成骨細(xì)胞，利用差時貼壁法去除成纖維細(xì)胞，對成骨細(xì)胞進(jìn)行有效純化。通過形態(tài)觀察、ALP染色鑒定表明具有成骨細(xì)胞的典型生物學(xué)行為。
　　(4)表面化學(xué)刺激對成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化的影響：以SD大鼠顱骨成骨

6、細(xì)胞為模型細(xì)胞，以TCPS為對照，將成骨細(xì)胞與SAMs復(fù)合培養(yǎng)，考查了成骨細(xì)胞在不同SAMs上的增殖、分化和礦化能力。MTT結(jié)果表明，細(xì)胞在-OH和-NH2表面增殖能力都優(yōu)于其他材料，相對平均細(xì)胞增殖能力-NH2組>-COOH組>TCPS組>-OH組>-CH3組>Au；ALP結(jié)果表明，細(xì)胞培養(yǎng)1-7天，各基底表面ALP活性較低，分化程度低；隨著培養(yǎng)時間的延長，各培養(yǎng)組的ALP活性均有增加，但在培養(yǎng)了7-17天時，各組材料的ALP活性仍不

7、及TCPS；細(xì)胞培養(yǎng)19天，-OH和-CH3組ALP活性最強；礦化結(jié)節(jié)定量檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)21天，各組基底材料均能促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的形成，與TCPS比較，-CH3、-NH2和-COOH組差異顯著（P<0.005），其中，-CH3組的差異最為明顯（P<0.005）。
　　(5)表面化學(xué)刺激對成骨細(xì)胞細(xì)胞骨架和整合素的影響：模型細(xì)胞采用SD大鼠顱骨成骨細(xì)胞，以TCPS為對照，成骨細(xì)胞培養(yǎng)在各基質(zhì)表面上，考查了成骨細(xì)胞在不同S

8、AMs上的鋪展和整合素分泌情況。結(jié)果表明，-CH3促進(jìn)細(xì)胞在材料上的鋪展，細(xì)胞中肌動蛋白纖維排列整齊有序，但其整合素分泌較少；-OH整合素分泌最多，細(xì)胞鋪展較充分。
　　綜上所述，SAMs表面通過刺激預(yù)吸附蛋白纖連蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化，將自身表面化學(xué)性質(zhì)作為一種生物語言傳遞給細(xì)胞上的整合素-細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，介導(dǎo)細(xì)胞的粘附、增殖、分化、鋪展和礦化等行為。與TCPS相比，親水性-OH和-COOH表面對纖連蛋白的構(gòu)象影響最低，促進(jìn)成骨細(xì)