TR3 LBD的分子機理和結構研究.pdf

1、第一章核受體與核孤兒受體TR3概述
　　 核受體是一類進化上相關的、具有共同結構特征、能夠與DNA特異結合的轉錄因子。它們能以單體、同源二聚體或者異源二聚體的形式結合到相應的激素應答元件上，對靶基因的轉錄進行調控，在生物體的生長發(fā)育、細胞分化、存活和凋亡以及維持內穩(wěn)態(tài)平衡等多種生理活動中發(fā)揮重要作用。由于其功能重要而復雜，很多核受體與諸如癌癥、糖尿病、老年癡呆、心血管疾病、不育癥和激素抵抗綜合征等多種疾病有著密切關系，因此核受體

2、也成為了藥物研發(fā)的重要標靶。經典核受體轉錄激活功能受配體的調節(jié)，因此尋找和研究核受體的配體，對靶向核受體的藥物的研發(fā)具有重要意義。
　　 TR3（也稱Nur77、NGFI-B、N10和NAK1）是由立早基因(immediate-early genes) NR4A1編碼的孤兒受體，是核受體超家族的重要成員之一。它在結構上具有核受體的典型特征，但其內源性配體至今尚未被發(fā)現(xiàn)，因此也被稱為核孤兒受體（orphan nuclear rec

3、eptor）。TR3能夠以細胞特異的方式在各種不同外界信號(如血清、生長因子、炎癥因子、內分泌素、抗原受體連接(antigen receptor ligation)以及凋亡刺激）的誘導下迅速表達，并在調控細胞生長、分化、凋亡、能量代謝、炎癥反應血管再生等過程中發(fā)揮重要的作用。作為轉錄因子，TR3以單體、同源二聚體和異源二聚體與不同的應答元件NBRE、NurRE或DR5結合，調控許多基因的轉錄，從而參與調控許多生命過程;TR3還能夠出核轉

4、定位于線粒體，誘導細胞凋亡。此外，TR3還能夠作為調控蛋白，通過蛋白質之間的相互作用來影響其他蛋白的生物學功能。
　　 本章節(jié)對核受體超家族和孤兒受體TR3的結構、作用機制和生物學功能及藥物開發(fā)或配體研究情況進行了綜述。
　　 第二章生物大分子X射線晶體學
　　 結構生物學通過研究生物大分子（尤其是蛋白和核酸分子）、大分子復合物或組裝體的結構及其結構與功能的關系，來揭示生命現(xiàn)象的物理和化學本質。目前已經發(fā)展成熟的

5、研究生物大分子結構的方法有多種，其中X射線晶體學、核磁共振技術(NMR)和冷凍電鏡(cryo-(EM)三維重構是當今結構生物學的主要研究手段。這三種方法各有獨到之處，又有局限和不足。作為最早發(fā)展起來的結構生物學研究手段，X射線晶體學以其分辨率高，原子坐標精確，不受蛋白大小限制等優(yōu)點成為目前解析蛋白質結構的主要手段。目前PDB(Protein Data Bank)中收錄的蛋白結構中有大約85％是利用X射線晶體學的方法獲得的。
　　

6、 本章對本論文重點使用的技術手段——X射線晶體學進行以下幾方面的介紹:蛋白晶體的培養(yǎng)、衍射數(shù)據的收集處理、X射線晶體學的基本原理、相位獲取的方法原理、模型構建及修正等。對于本論文采用的分子置換法解相角的原理和相關軟件我們做重點介紹。
　　 第三章小分子拮抗劑TMPA靶向TR3 LBD的結構研究
　　 TR3 LBD缺乏典型的配體結合口袋(LBP)及共激活因子結合位點。最近發(fā)現(xiàn)小分子化合物Cytosporone B(Csn

7、-B)能夠結合TR3的LBD激活TR3下游基因的轉錄。如今，吳喬實驗室又發(fā)現(xiàn)Csn-B的一種衍生物TMPA(ethyl2-[2，3，4trimethoxy-6(1-octanoyl) phenyl] acetate)可以通過結合TR3 LBD來阻斷TR3與LKB1的相互作用，從而激活AMPK信號通路，影響糖代謝。為了證明TMPA能夠直接結合TR3 LBD影響LKB1-AMPK信號轉導，我們與吳喬實驗室合作，對TMPA與TR3 LBD的復

8、合物結構展開了研究。通過本章研究，我們獲得了2.06(A)的TR3 LBD晶體結構和2.22(A)的TMPA-TR3 LBD復合物晶體結構。通過結構對比發(fā)現(xiàn)TMPA的結合并不改變TR3 LBD的構象;TMPA在TR3 LBD上有兩個結合位點Site A和Site B，這兩個位點都不是深埋于LBD內部的典型配體結合口袋，而是LBD分子表面的兩個淺縫;對基于結構設計的突變體進行熒光實驗發(fā)現(xiàn)Site A的C566對于TMPA的結合至關重要，而

9、T595對于LKB1的相互作用很重要。說明Site A在LKB1結合位點附近，TMPA結合到SiteA上能夠阻斷LBD1的結合。
　　 通過本章的研究，不僅從結構角度證明了TMPA能夠結合TR3 LBD，并且闡明了TMPA與TR3 LBD的作用位點及其影響LKB1結合TR3 LBD的作用機制。更為今后以TMPA為藥物前體，進行基于結構的藥物設計，開發(fā)靶向TR3 LBD治療糖尿病的藥物奠定了基礎。
　　 第四章核孤兒受體T

10、R3 LBD結構域的二聚化研究
　　 TR3家族受體能夠以單體、同源二聚體、家族內異源二聚體的形式調控下游基因的轉錄激活，TR3還能夠與RXR異源二聚化結合相應應答元件。核受體的經典二聚化位點為H9-H10區(qū)域，體內研究顯示Nurr1（TR3家族的另一個成員）與RXR的二聚化與I-box（位于H10C端）有關但不能排除還有其他I-box以外的二聚化位點。本章首先對TR3家族LBD的晶體結構進行了研究，發(fā)現(xiàn)TR3家族LBD晶體中都

11、不存在H9-H10區(qū)域的分子間相互作用，這與其他大部分核受體不同。我們的晶體結構中TR3 LBD以H11-H12疏水面發(fā)生二聚化，軟件分析該二聚化界面面積為592(A)2，具有特異性，并且TR3家族成員的LBD晶體結構中都存在此相互作用面。X射線小角散射實驗、凝膠過濾層析及分析性超速離心證明TR3 LBD在溶液狀態(tài)下主要以單體形式存在，少量為二聚體及多聚體。低pH值有利于LBD二聚體的穩(wěn)定，這與我們在低pH值條件下才能獲得衍射能力強的T