納米銀誘導(dǎo)氧化應(yīng)激及其毒性機(jī)制研究.pdf

1、納米科技快速發(fā)展，納米材料相關(guān)產(chǎn)品不斷開(kāi)發(fā)和廣泛應(yīng)用。由于納米銀具有獨(dú)特的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性，因此被廣泛應(yīng)用于光學(xué)、衛(wèi)生、保健、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，是目前商品化程度最高的納米材料之一。納米銀產(chǎn)品的不斷開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，人體可能直接接觸納米銀相關(guān)產(chǎn)品或者暴露于含納米銀的環(huán)境中，這可能對(duì)人體構(gòu)成潛在威脅。體內(nèi)研究顯示納米銀可以通過(guò)不同的途徑進(jìn)入生物體，繼而跨越生物屏障分布到不同的組織器官，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一定的毒作用。體內(nèi)研究提示肝臟和肺臟可能是納米銀的蓄

2、積和作用靶器官。體外細(xì)胞研究表明，納米銀可以引起多種細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性、遺傳毒性、神經(jīng)毒性和免疫毒性。目前，關(guān)于納米銀引起細(xì)胞毒性的作用機(jī)制還不是十分清楚，還有許多問(wèn)題亟待解決。比如納米銀引起細(xì)胞毒作用與氧化應(yīng)激關(guān)系，納米銀的毒作用是由納米銀粒子還是其釋放的銀離子引起。
　　因此本研究選擇靶器官肺臟、肝臟來(lái)源的兩種細(xì)胞株作為研究對(duì)象，人肺癌細(xì)胞(A549)和人肝癌細(xì)胞（HepG2）。通過(guò)一系列研究比較納米銀對(duì)兩株細(xì)胞的毒效應(yīng)，并探討

3、氧化應(yīng)激與細(xì)胞毒作用關(guān)系，考察納米銀釋放的銀離子在細(xì)胞毒性中的作用，進(jìn)一步研究其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。
　　1、納米銀表征與體外穩(wěn)定性研究:PVP包被納米銀經(jīng)透射電子顯微鏡(TEM)觀察，納米銀顆粒為球形，分散均勻，無(wú)團(tuán)聚現(xiàn)象，平均粒徑為23.44±4.92 nm。馬爾文粒度分析儀測(cè)得使用不含血清的DMEM培養(yǎng)液分散的納米銀平均水合粒徑為61.89 nm，而使用含10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)液分散的納米銀平均水合粒徑為51.58

4、nm，表明納米銀顆粒在培養(yǎng)液中有團(tuán)聚現(xiàn)象，血清有助于其分散。使用超純水、PBS和生理鹽水分散的納米銀在4℃、25C和37℃孵育48 h內(nèi)最大紫外吸收峰和水合粒徑都沒(méi)有改變，而使用DMEM培養(yǎng)液稀釋的納米銀溶液在4℃條件下分散穩(wěn)定，在25℃和37℃時(shí)出現(xiàn)明顯團(tuán)聚現(xiàn)象，表明不同分散液、時(shí)間和溫度對(duì)納米銀體外分散都有影響。
　　2、納米銀對(duì)A549和HepG2細(xì)胞毒性研究:20～640μg/mL納米銀染毒A549和HepG2細(xì)胞24、4

5、8 h后，兩株細(xì)胞存活率均呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性下降;在相同染毒條件下，A549細(xì)胞存活率下降更加明顯。20～160μg/mL納米銀染毒兩株細(xì)胞24、48 h后可以引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，具體表現(xiàn)為:20、40μg/mL劑量下細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有明顯變化;80、160μg/mL劑量下細(xì)胞間距增加、細(xì)胞皺縮變圓、漂浮細(xì)胞增加、細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡。細(xì)胞凋亡率檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，染毒24 h后各劑量組A549細(xì)胞凋亡率變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而各劑量組HepG2細(xì)

6、胞凋亡率均增加;染毒48 h后，40～160μg/mL劑量組A549細(xì)胞和160μg/mL劑量組HepG2細(xì)胞凋亡率均增加。使用5mmol/L N-乙酰半胱氨酸(NAC)預(yù)處理細(xì)胞2h后，與相應(yīng)染毒時(shí)間的160μg/mL劑量組比較，兩株細(xì)胞凋亡率均顯著下降。以上研究表明納米銀可以引起兩株細(xì)胞增殖抑制、形態(tài)學(xué)改變和凋亡率增加，這可能與細(xì)胞內(nèi)活性氧增加相關(guān)。
　　3、納米銀對(duì)A549和HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激作用研究:脂質(zhì)過(guò)氧化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)

7、80、160μg/mL劑量組A549細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)含量顯著增加;而各劑量組HepG2細(xì)胞內(nèi)MDA含量都沒(méi)有顯著增加。超氧化物歧化酶(SOD)活力和谷胱甘肽(GSH)含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，納米銀染毒A549細(xì)胞24h后，SOD活力沒(méi)有明顯改變，GSH含量上升;染毒48 h后，SOD活力和GSH含量在40～160μg/mL劑量組下降。納米銀染毒HepG2細(xì)胞24、48 h后，SOD活力和GSH含量都表現(xiàn)為上升。此外，納米銀染毒兩株細(xì)胞48

8、h后，細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激蛋白Hsp70和HO-1表達(dá)都增加。以上研究表明納米銀可以引起A549細(xì)胞發(fā)生更明顯的脂質(zhì)過(guò)氧化，這可能與兩株細(xì)胞內(nèi)不同的氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。
　　4、細(xì)胞攝取納米銀定量及其分布研究:通過(guò)電感耦合等離子體質(zhì)譜檢測(cè)細(xì)胞攝取的銀含量，結(jié)果顯示納米銀染毒兩株細(xì)胞24、48 h后，細(xì)胞攝取銀含量都呈現(xiàn)劑量依賴性增加，但沒(méi)有時(shí)間依賴性。表現(xiàn)為低劑量時(shí)(20μg/mL)24 h細(xì)胞攝取的銀含量小于48 h;高劑量時(shí)(80、160

9、μg/mL)24 h細(xì)胞攝取的銀含量大于48 h。通過(guò)超速離心加超濾法分離染毒液銀離子和細(xì)胞內(nèi)銀離子發(fā)現(xiàn)，使用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液分散的納米銀溶液在0h時(shí)，銀離子含量呈劑量依賴性增加，其中160μg/mL染毒液銀離子釋放最多，約為37 ng/mL;于37℃孵育24、48 h后，只有在160μg/mL染毒液能檢測(cè)到微量銀離子。細(xì)胞內(nèi)銀離子含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞內(nèi)銀離子含量呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性增加，而HepG2細(xì)胞只呈現(xiàn)劑量依

10、賴性增加。硝酸銀染毒兩株細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)相同銀含量的硝酸銀對(duì)兩株細(xì)胞活力影響大于納米銀。經(jīng)TEM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，納米銀顆粒可以通過(guò)胞吞途徑進(jìn)入細(xì)胞，主要分布在A549細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和溶酶體中;在HepG2細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和溶酶體中。研究表明兩株細(xì)胞可以通過(guò)胞吞途徑攝取銀顆粒，并在細(xì)胞內(nèi)釋放銀離子，進(jìn)而引起細(xì)胞毒性。
　　5、納米銀誘導(dǎo)A549和HepG2細(xì)胞凋亡機(jī)制研究:納米銀染毒A549和HepG2細(xì)胞48 h后，Western Blot

11、ting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)A549和HepG2細(xì)胞內(nèi)Cytochrome C、AIF、Caspase3、Caspase8和Caspase9蛋白表達(dá)水平均顯著升高，Bcl-2/Bax的比值顯著降低。結(jié)果表明納米銀誘導(dǎo)兩株細(xì)胞凋亡涉及線粒體途徑和死亡受體途徑。
　　綜上所述，納米銀對(duì)A549和HepG2細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒性。兩株細(xì)胞在40～160μg/mL濃度下48 h，A549細(xì)胞比HepG2細(xì)胞顯示更明顯的增殖抑制和凋亡。納米銀可以通過(guò)胞