皮膚組織中小汗腺自發(fā)熒光現(xiàn)象及其共聚焦λ掃描分析.pdf

1、背景：100年前，Stubel發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞和組織產(chǎn)生的自發(fā)熒光可以應(yīng)用于疾病的診斷;Policard在1924年報道了關(guān)于腫瘤組織的自發(fā)熒光是來源于自發(fā)熒光基團(tuán)的研究;50年前，有研究描述了嗜酸性粒細(xì)胞的自發(fā)熒光現(xiàn)象并且提出其應(yīng)用于診斷和治療的可能性。然而，由于自發(fā)熒光具有熒光強(qiáng)度低、光譜復(fù)雜的難測性，限制了其研究的進(jìn)展。最近，由于熒光顯微鏡，激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope，CL

2、SM)等高敏感度，低信噪比設(shè)備的出現(xiàn)，我們實現(xiàn)了對自發(fā)熒光可靠的觀察和測量。因此，測量組織和細(xì)胞自發(fā)熒光特性和強(qiáng)度的相關(guān)技術(shù)在科學(xué)研究和臨床診斷方面有了應(yīng)用價值，被再次重視起來。近年來在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域當(dāng)中關(guān)于自發(fā)熒光的研究還主要集中于視網(wǎng)膜疾病、消化系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)腫瘤等幾種疾病的病理過程中，并應(yīng)用于這些疾病的診斷和治療中。皮膚自發(fā)熒光產(chǎn)生的原因在于皮膚組織中內(nèi)在的熒光基團(tuán)，以及在某些病理變化中產(chǎn)生的內(nèi)源性和外源性的自發(fā)熒光物質(zhì)。皮膚組織中

3、由于糖化反應(yīng)沉積的晚期糖化終產(chǎn)物(advanced glycolsylation end products，AGEs)具有自發(fā)熒光現(xiàn)象，并與許多疾病具有密不可分的關(guān)系，例如動脈粥樣硬化、心血管系統(tǒng)疾病、糖尿病及相關(guān)并發(fā)癥、腎病、血液透析等。而皮膚中小汗腺自發(fā)熒光鮮有報道，我實驗室在汗腺細(xì)胞的提取過程中偶然發(fā)現(xiàn)小汗腺細(xì)胞在熒光顯微鏡下的自發(fā)熒光現(xiàn)象，這引起我們的重視，進(jìn)行了關(guān)于小汗腺自發(fā)熒光光學(xué)特性的研究。
　　目的：我們了解到皮膚

4、產(chǎn)生的自發(fā)熒光監(jiān)測應(yīng)用于很多疾病診斷和治療的過程中，而皮膚組織中的小汗腺并沒有自發(fā)熒光的相關(guān)文獻(xiàn)資料，在本次實驗過程中，我們首次發(fā)現(xiàn)并且描述了小汗腺的自發(fā)熒光現(xiàn)象，通過對小汗腺自發(fā)熒光特點和自發(fā)熒光強(qiáng)度的研究，可以在小汗腺相關(guān)疾病的診斷和治療起著重要的作用。
　　方法：將皮膚組織進(jìn)行蘇木紅染色，并在熒光顯微鏡下觀察其中小汗腺的自發(fā)熒光現(xiàn)象;從志愿者的皮膚中提取出單個小汗腺細(xì)胞，進(jìn)行小汗腺細(xì)胞體外培養(yǎng)，在熒光顯微鏡下分別以紫外光、綠

5、光、藍(lán)光三種不同激發(fā)光觀察小汗腺自發(fā)熒光以及熒光隨小汗腺生長的變化情況;利用激光掃描共聚焦顯微鏡(confocallaser scanning microscope，CLSM)λ掃描測量小汗腺自發(fā)熒光的強(qiáng)度，進(jìn)一步了解小汗腺自發(fā)熒光的光譜學(xué)信息并根據(jù)其熒光強(qiáng)度推測引發(fā)小汗腺自發(fā)熒光的熒光基團(tuán)是哪些。
　　結(jié)果：蘇木紅染色后的小汗腺組織在綠色熒光蛋白GFP(green fluorescentprotein，GFP)濾光系統(tǒng)(470/

6、40nm)下顯示出綠色自發(fā)熒光，N2.1濾光系統(tǒng)(515-560nm)下顯示出紅色自發(fā)熒光;單獨的小汗腺細(xì)胞在熒光顯微鏡下則表現(xiàn)出更多顏色的自發(fā)熒光，紫外光的激發(fā)下顯示出藍(lán)色的自發(fā)熒光，藍(lán)色的激發(fā)光下顯示出綠色自發(fā)熒光，綠色的激發(fā)光下顯示出紅色的自發(fā)熒光，同時我們觀察到，隨小汗腺的生長，熒光強(qiáng)度沒有明顯減弱;CLSMλ分層掃描種植于confocal皿中的小汗腺測量其自發(fā)熒光的強(qiáng)度，我們發(fā)現(xiàn)了兩個自發(fā)熒光峰值，分別在530nm和590nm