NSTK對AD動物模型的神經(jīng)保護作用及調(diào)控能量代謝障礙的機制.pdf

1、阿爾茨海默疾?。ˋlzheimer’s disease，AD）是由多種因素誘發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD的病理機制復雜，對擬用于AD治療候選藥物的科學評價需采用能較準確模擬AD病理特征的模型，特別是相應的整體動物模型。AD的早期病理進程之一為能量代謝障礙，能量代謝障礙的發(fā)生和發(fā)展直接影響AD的其他病理進程包括炎癥及氧化應激等，因此針對能量代謝障礙的干預手段可有效提高AD的療效。
　　在前期神經(jīng)保護藥物的研究中，我們聚焦具有自主

2、知識產(chǎn)權的內(nèi)源性大麻素（anandamide，AEA）類似物脂肪酰氨基酸。通過系統(tǒng)研究，我們發(fā)現(xiàn)了水溶性強、穩(wěn)定及成藥性好的抗腦缺血的神經(jīng)保護候選藥─N-硬脂酰酪氨酸二鉀鹽（Dipotassium N-stearoyltyrosinate，NSTK）。在對NSTK成藥性的系統(tǒng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)NSTK作為脂肪酰胺水解酶（fatty acid amide hydrolase，F(xiàn)AAH）抑制劑，通過作用于大麻素系統(tǒng)（endocannabino

3、id system，ECS）干預腦缺血過程的多條損傷途徑，達到其神經(jīng)保護作用。由于對腦缺血損傷和AD損傷的干預有一定的相似性，我們在細胞水平對 NSTK抗 AD的活性及其機制進行了初步研究，發(fā)現(xiàn)其具有抗AD導致的氧化應激、興奮毒性等作用。為進一步評價NSTK治療AD的可行性及探討其機制，本文在AD動物模型上考察NSTK的神經(jīng)保護作用，研究其通過干預炎癥、氧化應激、糖代謝障礙等多個病理進程發(fā)揮的神經(jīng)保護作用機制；我們還通過U251細胞實驗

4、探討NSTK通過干預能量代謝障礙影響炎癥及氧化應激等病理進程的作用及其機制。
　　第一章 NSTK對AD動物模型的神經(jīng)保護作用
　　本章選擇APP/PS1/Tau三轉基因小鼠以及Tau單轉基因小鼠，通過動物行為學，組織病理學，ELISA實驗等，評價NSTK在轉基因AD動物模型上的神經(jīng)保護活性。我們觀察到NSTK（30 mg/kg，45 mg/kg）明顯改善APP/PS1/Tau三轉基因小鼠和Tau單轉基因小鼠的整體行為能力。

5、行為學實驗中，NSTK可劑量依賴性地改善轉基因小鼠的自主活動，焦慮行為及提高小鼠學習記憶能力。由于同Tau單轉基因小鼠相比APP/PS1/Tau三轉基因小鼠的行為學以及病理特征更加明顯，后續(xù)實驗中，AD動物模型均采用APP/PS1/Tau三轉基因小鼠。我們觀察了NSTK對APP/PS1/Tau三轉基因小鼠的神經(jīng)保護活性，采用免疫熒光和ELISA方法，觀察到NSTK顯著降低皮層和海馬區(qū)Aβ斑塊以及Aβ42和Aβ40的含量，降低NFTs的產(chǎn)

6、生，提高皮層和CA1區(qū)神經(jīng)元的存活率，抑制皮層和DG區(qū)星形膠質(zhì)細胞的活化。結果表明，NSTK在AD動物模型上表現(xiàn)出較好的神經(jīng)保護活性，該活性可能涉及協(xié)同干預多個病理進程。以上研究結果為具有良好成藥性的抗腦缺血神經(jīng)保護候選藥NSTK應用于AD治療提供了積極的實驗數(shù)據(jù)。
　　第二章 NSTK對APP/PS1/Tau轉基因小鼠多損傷途徑干預的神經(jīng)保護作用機制
　　AD的病理機制涉及炎癥、氧化應激、糖代謝障礙等多條損傷途徑，僅干預單

7、一的病理進程對AD的防治療效有限，協(xié)同干預多條損傷途徑可有效提高AD療效。我們通過Elisa和Western blotting實驗，觀察了NSTK對APP/PS1/Tau轉基因小鼠的海馬組織中與炎癥、氧化應激、糖代謝障礙等病理進程中相關細胞因子及蛋白表達的影響。NSTK（30 mg/kg，45 mg/kg）處理APP/PS1/Tau轉基因小鼠可明顯降低海馬組織中炎性因子（IL-1β，TNF-α）的含量及下調(diào)與炎癥相關蛋白NF-κB的表達

8、；降低海馬組織中脂質(zhì)過氧化物MDA的含量，提高與氧化應激水平相關酶CAT、SOD的活力；提高海馬組織中葡萄糖的含量及上調(diào)與葡萄糖代謝及調(diào)控葡萄糖代謝信號轉導的相關蛋白（GLUTs、p-AMPK）的表達。以上實驗結果在轉基因動物水平進一步證明，NSTK可通過抑制炎癥、氧化應激、糖代謝障礙等多條損傷途徑起到較好的神經(jīng)保護作用。這些觀察不僅從機制上支撐了上一章得出的“NSTK對AD動物模型具有良好的神經(jīng)保護作用”的結論，也為下一章基于U251

9、細胞開展的“NSTK對能量代謝障礙的調(diào)控作用及對炎癥、氧化應激損傷修復的影響”的研究奠定整體動物的實驗基礎。
　　第三章 NSTK調(diào)控U251細胞能量代謝障礙及其機制
　　能量代謝障礙是AD發(fā)生發(fā)展的早期事件，干預能量代謝障礙對AD發(fā)生發(fā)展中出現(xiàn)的炎癥和氧化應激等病理進程有重要的影響。調(diào)控能量代謝障礙并通過調(diào)控能量代謝障礙改善炎癥和氧化應激等病理進程有助于提高AD的療效。
　　能量代謝障礙的主要表現(xiàn)是葡萄糖攝取下降。本

10、章采用U251細胞建立模擬能量代謝障礙的低氧損傷模型，并進一步評價了NSTK逆轉低氧引起的U251細胞中葡萄糖攝取下降的活性及機制。NSTK（1μmol/L–5μmol/L）處理48 h-96 h可時間、劑量依賴性地逆轉了低氧引起的U251細胞葡萄糖攝取障礙。NSTK處理U251細胞48 h對低氧誘導的U251細胞的葡萄糖攝取障礙逆轉作用明顯，而對其IL-1β、TNF-α釋放的增加以及MDA生成的增加逆轉作用不明顯，NSTK處理72 h

11、和96 h均能逆轉上述指標，表明NSTK逆轉葡萄糖攝取障礙的作用先于炎癥和氧化應激的作用，提示NSTK逆轉葡萄糖攝取障礙可能進一步影響其對細胞中 IL-1β、TNF-α釋放以及MDA生成增加的逆轉作用。低氧模型U251細胞中的葡萄糖攝取相關蛋白GLUTs表達明顯減少，而NSTK處理96 h能有效地逆轉上述GLUTs蛋白表達的減少，表明低氧導致 U251細胞的能量代謝障礙及NSTK對該過程的干預均與GLUTs蛋白表達的變化有關。AMPK抑

12、制劑可逆轉NSTK上調(diào)細胞中總GLUTs和細胞膜上GLUTs蛋白表達，而PI3K抑制劑不能逆轉此過程，表明NSTK調(diào)控GLUTs干預低氧損傷U251細胞能量代謝的機制可能通過AMPK介導的通路，而不依賴于PI3K通路所介導。進一步，我們還發(fā)現(xiàn)AMPK抑制劑能逆轉NSTK對低氧損傷U251細胞葡萄糖攝取、炎癥及氧化應激水平的作用，而PI3K抑制劑無此作用，表明AMPK通路可能參與NSTK調(diào)控葡萄糖攝取、炎癥和氧化應激過程，而這些過程不依賴

13、于PI3K通路所介導。最后，通過觀察低氧損傷U251細胞應用NSTK后及存在AMPK抑制劑等條件下p-AMPK的蛋白表達的變化，發(fā)現(xiàn)NSTK可上調(diào)低氧損傷U251細胞中p-AMPK的表達，進一步證實 AMPK確實介導了 NSTK調(diào)控低氧損傷 U251細胞葡萄糖攝取、炎癥和氧化應激過程。本章闡明了NSTK干預低氧損傷細胞中能量代謝障礙的作用，該作用對炎癥、氧化應激損傷的修復的影響，以及上述作用的信號轉導通路。這些研究結果為NSTK應用于A

14、D治療提供了理論支撐，也豐富了大麻素系統(tǒng)介導的神經(jīng)保護藥物的作用機制理論研究。
　　本研究：
　?。?）基于動物模型進一步證實了NSTK對AD的神經(jīng)保護活性，其在整體動物上的數(shù)據(jù)為治療AD提供了實驗基礎，提示NSTK作為治療AD的候選藥物具有進一步的研發(fā)價值。
　?。?）闡釋了NSTK通過干預能量代謝障礙、炎癥和氧化應激等多條損傷途徑，發(fā)揮神經(jīng)保護作用的機制，這一結果豐富了NSTK作為神經(jīng)保護劑的理論依據(jù)。