光學(xué)分子影像技術(shù)在肝癌動(dòng)物模型構(gòu)建及診療中的應(yīng)用研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　一、光學(xué)分子影像技術(shù)輔助下肝癌動(dòng)物模型的建立
　　目的:
　　1.借助光學(xué)分子影像技術(shù)構(gòu)建裸鼠皮下和原位移植性肝癌動(dòng)物模型。
　　2.為后續(xù)肝癌藥物療效評(píng)估和診療搭建前期動(dòng)物模型平臺(tái)。
　　方法:
　　1.HepG2-fLuc和HepG2-GFP標(biāo)記的肝癌細(xì)胞裸鼠皮下肝癌模型的建立取20只4-6周雄性BALB/c裸鼠，分別抽取含1.0×107/mlHepG2-fLuc和

2、HepG2-GFP細(xì)胞懸液接種于裸鼠腋部皮下，HepG2-fLuc細(xì)胞接種于左腋下，HepG2-GFP細(xì)胞接種于右腋下，各10只，建立裸鼠皮下移植性肝癌模型。
　　2.HepG2-fLuc標(biāo)記的肝癌細(xì)胞裸鼠原位肝癌模型的建立
　　無菌條件下麻醉裸鼠，經(jīng)右側(cè)肋緣下1cm斜切口開腹顯露肝臟，沿肝臟被膜下進(jìn)針，緩慢推入含1.0×107/ml HepG2-fLuc細(xì)胞懸液，逐層關(guān)腹，同樣方法建立10只原位模型。
　　3.以上兩

3、種裸鼠肝癌模型在腫瘤細(xì)胞接種完成后，借助IVIS200分子影像系統(tǒng)每日觀察裸鼠的出瘤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況并測(cè)量熒光強(qiáng)度、進(jìn)行三維重建測(cè)量腫瘤體積等、繪制體積/熒光/時(shí)間增長(zhǎng)曲線、統(tǒng)計(jì)成瘤率、記錄荷瘤裸鼠生存時(shí)間。荷瘤裸鼠死亡后，剝離瘤塊進(jìn)行病理學(xué)檢查。
　　結(jié)果:
　　1.二維定量分析結(jié)果：
　　使用工具欄中的感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)定量分析工具條對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行圈選定量，定量數(shù)據(jù)出現(xiàn)在ROI

4、上方，信號(hào)的強(qiáng)弱以圖中的假色條表示，藍(lán)色表示信號(hào)弱，紅色表示信號(hào)強(qiáng)，假色條上均有數(shù)值標(biāo)尺，下方顯示定量單位及數(shù)值上下限。
　　2.三維重建結(jié)果：
　　三維可視化模型分別從冠狀面、矢狀面和水平面再現(xiàn)了裸鼠各臟器結(jié)構(gòu)，且可以任意角度旋轉(zhuǎn)放大透明化，并可以顯示腫瘤位置和定量測(cè)量腫瘤體積，便于觀察。
　　3.全部裸鼠瘤細(xì)胞接種后均未出現(xiàn)感染等并發(fā)癥。
　　4.生物熒光成像(BLI)和自發(fā)熒光成像(FMI)增長(zhǎng)情況。

5、>　　5.腫瘤體積、生物熒光強(qiáng)度值和激發(fā)熒光強(qiáng)度值相關(guān)性分析
　　結(jié)論:
　　1.裸鼠皮下和原位移植性肝癌模型具有操作簡(jiǎn)便、成瘤率高、腫瘤生長(zhǎng)周期短、易于控制等優(yōu)點(diǎn)，是研究肝癌生物學(xué)行為和篩選抗癌藥物及診療方式的理想模型。
　　2.腫瘤生物熒光強(qiáng)度和激發(fā)熒光強(qiáng)度和腫瘤體積均呈現(xiàn)高度相關(guān)性，可反映腫瘤內(nèi)活細(xì)胞數(shù)量。
　　3.光學(xué)分子影像技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、連續(xù)、直觀地觀測(cè)裸鼠活體內(nèi)肝癌腫瘤的生物學(xué)行為。<

6、br>　　二、光學(xué)分子影像技術(shù)輔助下芹黃素對(duì)肝癌抑制作用的研究
　　目的:
　　1.光學(xué)分子影像技術(shù)輔助下研究芹黃素對(duì)肝癌的抑制作用，以期為發(fā)現(xiàn)新的肝癌治療藥物提供有益的參考。
　　2.探索驗(yàn)證光學(xué)分子影像技術(shù)在觀察藥物抗肝癌療效中的應(yīng)用價(jià)值。
　　方法:
　　1.肝癌皮下腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)
　　將20只Balb/c裸鼠隨機(jī)分為2組:對(duì)照組（生理鹽水組）和實(shí)驗(yàn)組（芹黃素組），每組各10只，按照本論文第一部分

7、介紹方法分別用HepG2-fLuc和HepG2-GFP標(biāo)記的肝癌細(xì)胞懸液接種到裸鼠上肢左腋窩和右腋窩處建立肝癌皮下腫瘤模型。
　　2.肝癌原位腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)
　　將20只Balb/c裸鼠隨機(jī)分為2組:對(duì)照組（生理鹽水組）和實(shí)驗(yàn)組（芹黃素組），每組各10只，按照本論文第一部分介紹方法分別用HepG2-fLuc標(biāo)記的肝癌細(xì)胞懸液接種到肝臟包膜下建立肝癌原位腫瘤模型。
　　3.給藥方法
　　待皮下和原位肝癌移植模型成功建

8、立后開始根據(jù)各實(shí)驗(yàn)分組情況給予相應(yīng)的不同藥物處理:(1)對(duì)照組:每3天腹腔注射等容量的無菌生理鹽水，共7次;(2)實(shí)驗(yàn)組:芹黃素50mg/kg，腹腔注射，每3天注射1次，共7次。
　　4.各組比較和檢測(cè)指標(biāo)
　　每天觀察裸鼠的體重、精神狀態(tài)、飲食情況、活動(dòng)規(guī)律及排便等一般情況觀察。IVIS200分子影像系統(tǒng)測(cè)量腫瘤熒光強(qiáng)度變化，三維重建測(cè)量腫瘤體積變化，并繪制比較各組肝癌移植瘤體積和熒光強(qiáng)度增長(zhǎng)曲線。
　　5.動(dòng)物處置

9、與標(biāo)本獲取
　　待全荷瘤鼠死亡后，剝離瘤體，觀察大體形態(tài)并稱取瘤重，將各個(gè)瘤組織分成兩部分，一部分固定包埋后做病理檢查，余下的瘤組織放-80℃凍存。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　連續(xù)變量采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，組間整體比較采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析，單獨(dú)時(shí)間點(diǎn)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。用Kaplan-Meier法繪制荷瘤裸鼠生存時(shí)間并用log rank檢驗(yàn)比較。數(shù)據(jù)分析采用IBM SPSS19.0軟件分析，P

10、＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Prism5.0軟件繪制圖表。
　　結(jié)果:
　　1.裸鼠一般情況
　　20只皮下腫瘤裸鼠接種肝癌細(xì)胞10天左右，出現(xiàn)粟粒大小的類圓形結(jié)節(jié)，高出皮膚表面，質(zhì)韌，可活動(dòng)，以后結(jié)節(jié)逐漸增大，移植成功率為100％。
　　2.芹黃素抗肝癌腫瘤作用
　　待肝癌移植模型成功建立后按分組情況開始給藥，治療開始后每天測(cè)量移植瘤體積及相應(yīng)熒光強(qiáng)度值，并繪制移植瘤體積和熒光強(qiáng)度增長(zhǎng)曲線。
　

11、　結(jié)論:
　　1.芹黃素對(duì)肝癌具有明顯的抑制作用，為肝癌的綜合治療提供了新方案。
　　2.光學(xué)分子影像技術(shù)能直接快速的測(cè)量肝癌腫瘤模型中腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移以及對(duì)藥物的反應(yīng)，在對(duì)藥物的篩選和評(píng)價(jià)中具有重要應(yīng)用價(jià)值。
　　三、光學(xué)分子影像技術(shù)在確定肝臟腫瘤位置及邊界中的應(yīng)用研究
　　目的:
　　借助光學(xué)分子影像手術(shù)導(dǎo)航系統(tǒng)進(jìn)行前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及初步臨床驗(yàn)證，以期利用該方法達(dá)到在術(shù)中快速、準(zhǔn)確、客觀的定位肝臟腫瘤及轉(zhuǎn)移

12、病灶組織的邊界及判斷腫瘤切除后斷面有無殘留病灶，達(dá)到精準(zhǔn)、完整切除腫瘤的目的。
　　（一）前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　方法:
　　1.主要實(shí)驗(yàn)試劑注射用吲哚菁綠(indocyanine green，ICG)。
　　2.主要實(shí)驗(yàn)儀器
　　IVIS200非侵入式定量分子影像系統(tǒng)
　　光學(xué)分子影像手術(shù)導(dǎo)航系統(tǒng)（Surgical navigation system，SNS）
　　3.實(shí)驗(yàn)對(duì)象和分組
　　將3

13、0只Balb/c裸鼠分別用HepG2-fLuc標(biāo)記的細(xì)胞接種到上肢左腋窩后隨機(jī)分為2組:對(duì)照組（常規(guī)手術(shù)組）和實(shí)驗(yàn)組（SNS引導(dǎo)手術(shù)組），每組各15只。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　連續(xù)變量采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，對(duì)于計(jì)數(shù)資料，組間比較采用x2檢驗(yàn)或Fisher's精確檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。用Kaplan-Meier法繪制荷瘤鼠術(shù)后生存曲線并用log rank檢驗(yàn)比較兩組生存時(shí)間。數(shù)據(jù)分析采用IBM SPSS19.0軟件

14、分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Prism5.0軟件繪制圖表。
　　結(jié)果:
　　SNS手術(shù)導(dǎo)航組在腫瘤殘余率(6.7％ vs.46.7％，p=0.035)方面顯著少于常規(guī)手術(shù)組，常規(guī)手術(shù)組裸鼠的生存天數(shù)最小值為19天，最大值為48天，生存均值為36天，生存中位數(shù)為38天，手術(shù)導(dǎo)航組裸鼠的生存天數(shù)最小值為43天，最大值為68天，生存均值為54天，生存中位數(shù)為54天，生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于常規(guī)肉眼手術(shù)切除方法的裸鼠，兩組比較差

15、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.000)，這也說明這種精確治療可以有效的提高生存率，改善預(yù)后效果。
　　（二）初步臨床驗(yàn)證
　　方法:
　　1.研究對(duì)象
　　選擇對(duì)象為在南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院肝膽一科住院待手術(shù)病人。
　　2.倫理學(xué)要求
　　遵循赫爾辛基宣言和中國(guó)有關(guān)臨床試驗(yàn)研究規(guī)范、法規(guī)進(jìn)行。在試驗(yàn)開始之前，已通過本實(shí)驗(yàn)研究單位南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)認(rèn)定。
　　3.實(shí)驗(yàn)方法
　　本研究

16、采光學(xué)分子影像手術(shù)導(dǎo)航系統(tǒng)引導(dǎo)下的ICG對(duì)肝臟腫瘤患者進(jìn)行腫瘤切除手術(shù)，將切除的病灶行病理檢查，探討其在肝臟腫瘤邊界界定及發(fā)現(xiàn)殘余病灶中的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　結(jié)果:
　　自2014年12月到2015年3月，共5例病人在我院實(shí)施了在光學(xué)分子影像手術(shù)導(dǎo)航系統(tǒng)引導(dǎo)下的肝臟腫瘤切除術(shù)，其中3例為肝細(xì)胞癌，1例為轉(zhuǎn)移性肝癌，1例為局灶增生性結(jié)節(jié)。所有受試者在提供書面知情同意后，醫(yī)生對(duì)實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行充分解釋。所有患者術(shù)前均行腹部超聲和增強(qiáng)