AREG-EGFR信號(hào)軸介導(dǎo)胰腺癌EMT效應(yīng)及相關(guān)機(jī)制的研究與人胰腺星形細(xì)胞永生化建系.pdf

1、由于大部分胰腺癌患者被確診時(shí)疾病已經(jīng)發(fā)展至進(jìn)展期，因而喪失了通過手術(shù)完全切除腫瘤的機(jī)會(huì)。加之胰腺癌對于放療、化療治療的敏感性有限。使得尋找有關(guān)胰腺癌診斷、治療及判斷患者預(yù)后的新標(biāo)志物意義重大。胰腺星形細(xì)胞(PSC)與胰腺癌細(xì)胞的相互作用是胰腺癌發(fā)病機(jī)制研究的熱點(diǎn)，這兩種細(xì)胞間的相互作用能更真實(shí)地模擬胰腺癌復(fù)雜的微環(huán)境。
　　目的:
　　第一部分 對AREG/EGFR在胰腺癌中的表達(dá)及其作用進(jìn)行探討。
　　(1)對EGF

2、R、EGFRvⅢ和AREG在胰腺癌組織中的表達(dá)情況及其與病人的臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性進(jìn)行研究;
　　(2)對AREG/EGFR信號(hào)軸介導(dǎo)胰腺癌EMT效應(yīng)及相關(guān)機(jī)制進(jìn)行研究。
　　第二部分 對人胰腺星形細(xì)胞進(jìn)行永生化建系處理，為后期繼續(xù)研究AREG在PSC中所起的作用提供實(shí)驗(yàn)材料基礎(chǔ)。
　　方法：
　　第一部分
　　(1)首先，采用免疫組織化學(xué)染色對92例胰腺導(dǎo)管腺癌組織進(jìn)行EGFR、EGFRvⅢ和ARE

3、G表達(dá)檢測，通過卡方檢驗(yàn)判斷EGFR、EGFRvⅢ、AREG及AREG/EGFR共表達(dá)情況與胰腺癌臨床特征的關(guān)系，利用Pearson檢驗(yàn)對AREG表達(dá)和EGFR表達(dá)之間進(jìn)行相關(guān)性分析;制作Kaplan-Meier生存曲線，通過log-rank檢驗(yàn)比較高表達(dá)/低表達(dá)組間的生存差異，最后利用COX回歸進(jìn)行多因素分析。
　　(2)利用RNA干擾技術(shù)和重組蛋白研究AREG對胰腺癌細(xì)胞系自身侵襲和遷移能力的影響。采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞遷移實(shí)

4、驗(yàn)和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力，使用MMP/TIMP蛋白質(zhì)芯片篩選AREG對胰腺癌MMP/TIMP蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，利用Western blot驗(yàn)證AREG/EGFR對胰腺癌細(xì)胞系EMT蛋白及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)的影響，使用EGFR、MEK1/2和NF-κB抑制劑驗(yàn)證AREG/EGFR活化下游信號(hào)通路改變情況。同時(shí)，驗(yàn)證AREG在4例原代培養(yǎng)PSC中的表達(dá)情況，研究PSC對胰腺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。
　　第二部分 建立人胰腺星形

5、細(xì)胞永生化細(xì)胞系。
　　使用重組慢病毒將SV40LT抗原基因和hTERT基因?qū)朐鷋PSC，經(jīng)過嘌呤霉素抗性篩選及擴(kuò)大培養(yǎng)。通過光學(xué)顯微鏡、免疫組化、染色體核型分析、生長曲線測定、裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)等研究其生物學(xué)特性。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　　(1)在胰腺癌組織中，EGFR陽性表達(dá)率為46.7％(43/92)，EGFRvⅢ陽性表達(dá)率為13％(12/92)，AREG陽性表達(dá)率為53.3％(49/92)。EGFR和

6、EGFRvⅢ陽性表達(dá)部位為細(xì)胞膜及細(xì)胞漿，AREG陽性表達(dá)部位為細(xì)胞漿;EGFR表達(dá)與腫瘤的分化程度相關(guān)，AREG/EGFR共表達(dá)與腫瘤的分化程度相關(guān);AREG表達(dá)和EGFR表達(dá)之間無相關(guān)性(Φ=0.039，P=0.709);單因素生存分析結(jié)果顯示，AREG表達(dá)(P=0.021，P=0.003)、TNM分期(P=0.003，P=0.001)和腫瘤分化程度(P=0.009，P=0.002)是胰腺癌患者DFS和OS預(yù)后不良的有關(guān)因素。多因素

7、分析結(jié)果顯示腫瘤分化程度(DFSHR=1.785，P=0.021; OS HR=2.125，P=0.004)是胰腺癌患者預(yù)后DFS和OS預(yù)后不良的獨(dú)立影響因素。此外，AREG表達(dá)(HR=1.822，P=0.03)、TNM分期(HR=2.25，P=0.03)和手術(shù)切緣狀態(tài)(HR=1.84，P=0.045)是胰腺癌患者OS預(yù)后不良的獨(dú)立影響因素。
　　(2)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞遷移能力實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:敲低AsPC-1細(xì)胞

8、AREG表達(dá)能顯著下調(diào)腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲能力。Western blot及IF結(jié)果顯示，敲低AREG表達(dá)使AsPC-1細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平發(fā)生改變，包括E-cadherin和ZO-1表達(dá)水平上升，Vimentin及β-catenin的表達(dá)水平下降，EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug和ZEB1的表達(dá)水平水平下調(diào);MMP/TIMP蛋白芯片結(jié)果顯示，AREG對胰腺癌多種MMP/TIMP蛋白質(zhì)表達(dá)有影響，其中對MMP-9影響最顯著。同

9、時(shí)，AREG受體EGFR的磷酸化水平顯著下調(diào);敲低AREG表達(dá)能拮抗AREG/EGFR信號(hào)軸對ERK、AKT和STAT3等多條信號(hào)通路活化作用。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB入核水平顯著下降。上調(diào)AREG表達(dá)能夠增強(qiáng)PANC-1細(xì)胞的遷移、侵襲能力。外源性升高AREG表達(dá)使PANC-1細(xì)胞E-Cadherin和ZO-1蛋白表達(dá)水平下調(diào)，Vimentin，β-catenin和MMP-9的蛋白表達(dá)水平上調(diào)，轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug表達(dá)增強(qiáng)，而ZEB

10、1表達(dá)改變不明顯;同時(shí)PANC-1細(xì)胞，AREG/EGFR信號(hào)軸可以活化ERK、AKT和STAT3信號(hào)通路，其中對ERK和AKT磷酸化水平的影響最為明顯，同時(shí)能夠增加PANC-1細(xì)胞NF-κB的轉(zhuǎn)錄入核水平，這種增強(qiáng)效應(yīng)能夠分別被PD153035和/或U1026減弱。AREG/EGFR信號(hào)軸對胰腺癌細(xì)胞遷移、侵襲和EMT效應(yīng)的上調(diào)作用能夠被QZN拮抗。AREG在4例原代培養(yǎng)PSC中可均見不同程度表達(dá)，PSC能顯著增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲

11、能力，這種對胰腺癌細(xì)胞的趨化效應(yīng)不能被AREG中和抗體所拮抗。
　　第二部分 采用outgrowth法培養(yǎng)原代PSC，原代PSC經(jīng)過SV40LT和hTERT重組慢病毒感染，嘌呤霉素連續(xù)篩選獲得高表達(dá)SV40LT基因和hTERT基因的hPSC細(xì)胞株im PSC; RT-qPCR及Western blot結(jié)果顯示im PSC細(xì)胞SV40LT和hTERT RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平高;IHC結(jié)果im PSCα-SMA和VIM染色陽性，胞漿內(nèi)

12、見棕黃色顆粒，im PSC呈典型PSC活化狀態(tài);此外，可見有極少部分細(xì)胞GFAP弱陽性表達(dá);染色體核型分析可見，im PSC染色體總數(shù)發(fā)生改變，眾數(shù)為60條;細(xì)胞生長曲線顯示:im PSC組細(xì)胞呈現(xiàn)典型“S”形生長曲線;裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，im PSC細(xì)胞在裸鼠體無成瘤性。
　　結(jié)論：
　　AREG表達(dá)是胰腺癌患者OS預(yù)后不良的獨(dú)立影響因素。AREG/EGFR信號(hào)軸能夠促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT效應(yīng)。其機(jī)制可能為:

13、AREG通過和受體EGFR相互結(jié)合，激活EGFR胞內(nèi)區(qū)(pY1068)磷酸化，通過AREG/EGFR信號(hào)軸活化胰腺癌細(xì)胞內(nèi)ERK、AKT和STAT3信號(hào)通路，上調(diào)NF-κB入核水平，繼而使EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail及Slug表達(dá)水平上調(diào)，抑制E-cadherin表達(dá)，并促使Vimentin和MMP-9表達(dá)，使胰腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT。AREG/EGFR信號(hào)軸可能是治療胰腺癌的潛在靶點(diǎn)，抑制該信號(hào)軸的激活在體外實(shí)驗(yàn)中能有效抑制胰腺癌的侵襲和