Src蛋白激酶抑制劑對5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響及意義.pdf

1、背景與目的：
　　據(jù)調(diào)查表明：結(jié)腸癌是世界第三常見的惡性腫瘤，其中一半以上發(fā)生在發(fā)達(dá)國家；近年來，發(fā)展中國家結(jié)腸癌的發(fā)病率也正逐步上升。在我國,結(jié)腸癌發(fā)病率和死亡率均較前有較大升高，其中發(fā)病率已居我國惡性腫瘤的第四位，死亡率居第五位,已嚴(yán)重危害我國人民的生命健康。目前，結(jié)腸癌的基本治療方法是早期手術(shù)切除，中晚期患者在手術(shù)切除的基本上，術(shù)后輔以化療的綜合性治療方案。然而，我國結(jié)腸癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)大多已處于中晚期，腫瘤細(xì)胞局部浸潤和轉(zhuǎn)移，

2、已破壞了結(jié)腸有效的粘膜屏障功能及腫瘤范圍不明顯，單純的手術(shù)治療無法切除所有腫瘤，容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。而在手術(shù)的基礎(chǔ)上，術(shù)前術(shù)后行化療治療，不但可以降低腫瘤分期分級(jí)，為手術(shù)切除創(chuàng)造可行性，還降低了術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，對患者無病生存期的延長有著重要意義。但臨床數(shù)據(jù)表明，對于該類患者手術(shù)切除癌腫后有很高的復(fù)發(fā)率，且對化療有較高的耐藥性，特別是5-氟尿嘧啶，許多患者最終因耐藥而導(dǎo)致死亡。然而，5-氟尿嘧啶是結(jié)腸癌化療中的基本藥物。因此，減少患者對

3、5-氟尿嘧啶耐藥的發(fā)生，降低復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，對中晚期結(jié)腸癌的預(yù)后治療效果的提高有著重要意義，是當(dāng)前結(jié)腸癌化療研究的重要環(huán)節(jié)之一。
　　Src蛋白是由原癌基因 src編碼，是位于細(xì)胞膜的非受體酪氨酸蛋白激酶（nrPTKs）家族中的一員，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。據(jù)報(bào)道，Src蛋白在多種腫瘤中呈現(xiàn)出高表達(dá)，而在結(jié)腸癌患者中高表達(dá)率為80％。因此，近年來 Src激酶抑制劑的研究已成為各種腫瘤治療的熱點(diǎn)。達(dá)沙替尼是一種二代Src激酶抑制劑

4、，體外實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)其與奧沙利鉑聯(lián)用于結(jié)腸癌細(xì)胞具有協(xié)同作用。目前有多項(xiàng)一期及二期臨床試驗(yàn)測試達(dá)沙替尼與紫杉醇，卡培他濱或奧沙利鉑聯(lián)用于乳腺癌，結(jié)腸癌等惡性腫瘤的治療研究。Araujo，J.C.等人的一項(xiàng)最新三期臨床研究結(jié)果表明：達(dá)沙替尼和紫杉醇聯(lián)用于前列腺癌治療，其療效不改善轉(zhuǎn)移性去勢療法抵抗的患者的生存期。但是，現(xiàn)在對于 src激酶抑制劑普遍的觀點(diǎn)是：與傳統(tǒng)的化療藥物聯(lián)用能改善患者的治療效果。然而，Carrato，A.等人做

5、的另外一項(xiàng)類似的三期臨床試驗(yàn)卻得出了相反的結(jié)果：受體酪氨酸激酶抑制劑舒尼替尼聯(lián)用FOLFIRI方案不改善轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者的生存期，且聯(lián)用導(dǎo)致更嚴(yán)重的安全問題。De Bouard，S.等人對于舒尼替尼的報(bào)道同樣可在細(xì)胞水平抑制Src激酶的活性。因此，結(jié)腸癌患者術(shù)后及化療過程中Src激酶抑制劑與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)用的療效尚不確定，有待進(jìn)一步研究。
　　研究表明：多種化療耐藥的發(fā)生與細(xì)胞凋亡的降低有關(guān)。本文基于此，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、MTS、We

6、stern blot等方法檢測達(dá)沙替尼和5-氟尿嘧啶對結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)Src蛋白的活性的影響；流式細(xì)胞儀、Western blot等方法研究5-氟尿嘧啶與達(dá)沙替尼聯(lián)用對比氟尿嘧啶單用對結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響；來進(jìn)一步研究src激酶抑制劑與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)用的療效及其影響。
　　一、達(dá)沙替尼和5-氟尿嘧啶對結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)Src蛋白表達(dá)活性的影響方法
　　1、MTS法檢測達(dá)沙替尼、5-氟尿嘧啶對結(jié)腸癌細(xì)胞存活率的影響。
　　2、We

7、stern blotting檢測5-氟尿嘧啶對結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)Src蛋白活性的影響。
　　3、Western blotting檢測達(dá)沙替尼對結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)Src蛋白活性的影響。
　　4、Western blotting檢測達(dá)沙替尼與5-氟尿嘧啶聯(lián)用對結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi) Src蛋白活性的影響。
　　結(jié)果：
　　1、達(dá)沙替尼、5-氟尿嘧啶對結(jié)腸癌細(xì)胞均能抑制細(xì)胞的存活
　　MTS結(jié)果顯示：SW480和HT29細(xì)胞用達(dá)沙替尼

8、20nM處理48小時(shí)后，用酶標(biāo)儀檢測的結(jié)果得出，細(xì)胞的存活率為80%；SW480和HT29細(xì)胞用5-氟尿嘧啶50uM處理48小時(shí)后，用酶標(biāo)儀檢測的結(jié)果得出，細(xì)胞的存活率為50%（即SW480和HT29細(xì)胞用5-氟尿嘧啶處理的IC50的條件為50uM處理48小時(shí)）。
　　2、5-氟尿嘧啶增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)src蛋白的活性
　　Western blotting結(jié)果顯示：用50uM濃度的5-氟尿嘧啶處理SW480和HT29細(xì)胞不同時(shí)

9、間，代表src激酶活性的p-src的表達(dá)明顯增加，且呈現(xiàn)出時(shí)間梯度依耐性。
　　3、達(dá)沙替尼抑制結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)src蛋白的活性
　　Western blotting結(jié)果顯示：用達(dá)沙替尼作用于SW480和HT29細(xì)胞24小時(shí)，代表src激酶活性的p-src的表達(dá)明顯降低，且呈現(xiàn)出濃度梯度依耐性；用20nM濃度的達(dá)沙替尼處理SW480和HT29細(xì)胞不同時(shí)間，代表src激酶活性的p-src的表達(dá)明顯增加，且呈現(xiàn)出時(shí)間梯度依耐性。

10、r>　　4、達(dá)沙替尼與5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)聯(lián)用抑制結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)src的激活
　　Western blotting結(jié)果顯示：達(dá)沙替尼與氟尿嘧啶聯(lián)用降低結(jié)腸癌細(xì)胞p-src的表達(dá)。
　　二、達(dá)沙替尼與5-氟尿嘧啶聯(lián)用對結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡效率的影響方法
　　1、流式細(xì)胞學(xué)方法測達(dá)沙替尼與5-氟尿嘧啶聯(lián)用對結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響。
　　2、Western blotting檢測達(dá)沙替尼與5-氟尿嘧啶聯(lián)用對結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)cle

11、aved-caspase-3、cleaved-caspase-7、PARP表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1、達(dá)沙替尼與5-氟尿嘧啶聯(lián)用降低的結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡
　　流式細(xì)胞儀結(jié)果表明：用達(dá)沙替尼與5-氟尿嘧啶聯(lián)用（達(dá)沙替尼20nM、5-氟尿嘧啶50uM）作用于結(jié)腸癌細(xì)胞HT29細(xì)胞，HT29細(xì)胞早期的凋亡率為7.8%；單用5-氟尿嘧啶（50uM），HT29細(xì)胞早期凋亡率為14.3%；兩組相比較：聯(lián)用組比5-氟尿嘧啶單用組

12、的凋亡率明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　2、達(dá)沙替尼與5-氟尿嘧啶聯(lián)用降低結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡信號(hào)的表達(dá)
　　Western blotting結(jié)果顯示：用達(dá)沙替尼與5-氟尿嘧啶聯(lián)用（達(dá)沙替尼20nM、5-氟尿嘧啶50uM）聯(lián)用作用于結(jié)腸癌細(xì)胞SW480和HT29細(xì)胞48小時(shí)后，細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)PARP、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-7的表達(dá)比單用5-氟尿嘧啶明顯降低，結(jié)果提示達(dá)沙

13、替尼與5-氟尿嘧啶聯(lián)降低結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡率。
　　三、結(jié)腸癌患者原發(fā)癌與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移癌組織標(biāo)本中Src蛋白的表達(dá)方法
　　Envision法檢測src蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)
　　結(jié)果
　　結(jié)腸癌復(fù)發(fā)組織比原發(fā)結(jié)腸癌中src蛋白表達(dá)較低
　　免疫組化結(jié)果顯示：經(jīng)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)同一患者原發(fā)癌的Src蛋白表達(dá)總體高于復(fù)發(fā)癌或轉(zhuǎn)移癌。提示癌癥復(fù)發(fā)可能來源于 Src低表達(dá)癌細(xì)胞對化療不敏感。Src的存在亦可能在腫瘤化療