系統(tǒng)性紅斑狼瘡血漿microRNA表達(dá)譜篩查與驗(yàn)證的初步研究.pdf

1、研究背景：
　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種病程反復(fù)的自身免疫性疾病，好發(fā)于育齡期的女性，主要表現(xiàn)在多個(gè)器官的受累，包括腎臟、皮膚、關(guān)節(jié)、血液和神經(jīng)系統(tǒng)等的炎癥反應(yīng)，疾病的活動(dòng)情況會(huì)隨著時(shí)間出現(xiàn)波動(dòng)，患者血清中會(huì)出現(xiàn)以抗核抗體為代表的多種自身抗體。我國(guó)的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，狼瘡的患病率高達(dá)70/10萬(wàn)。系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種多因素的復(fù)雜病，其臨床表現(xiàn)多種多樣，多呈隱匿起病，臨

2、床癥狀因個(gè)人差異不盡相同，這表明SLE的發(fā)病機(jī)制可能涉及多個(gè)因素的相互作用。系統(tǒng)性紅斑狼瘡的病因和發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，目前的觀點(diǎn)普遍認(rèn)為 SLE的致病因素包括自然環(huán)境因素（紫外線照射和化學(xué)物質(zhì)接觸等）、生物學(xué)環(huán)境（細(xì)菌、病毒感染等）、社會(huì)環(huán)境因素（壓力、精神創(chuàng)傷等）、基因易感性及內(nèi)分泌狀況等諸多方面。這些因素之間相互作用和影響，最終導(dǎo)致SLE病人體內(nèi)的免疫功能紊亂?，F(xiàn)在針對(duì)SLE的治療仍然是一個(gè)很大的爭(zhēng)論，雖然可緩解病情和提高病人生活

3、質(zhì)量的治療藥物被不斷的研發(fā)出來(lái)，但仍然沒(méi)有一個(gè)確定的特異性治療方法，還有大量病人的癥狀仍然無(wú)法得到徹底或有效的控制，而且長(zhǎng)期的炎癥和與藥物有關(guān)的副作用可能會(huì)造成永久性的器官損傷，這與該病預(yù)后的生命質(zhì)量下降以及死亡率的上升是密切相關(guān)的。因此對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡病因及發(fā)病機(jī)制的研究就顯得尤為重要。已有研究表明，輔助性T細(xì)胞（Th）在SLE及其它自身免疫疾病的發(fā)病中起重要作用。從免疫學(xué)上講，SLE是自身免疫耐受損傷和自身抗原介導(dǎo)的T、B淋巴細(xì)胞過(guò)

4、度活化所導(dǎo)致的。
　　微小RNA(microRNA，miRNA)是一類含有約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，主要通過(guò)與靶 mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)互補(bǔ)配對(duì)，從而造成 mRNA降解或蛋白質(zhì)的表達(dá)受到抑制，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控。人類大約有30％編碼蛋白的基因受miRNAs調(diào)節(jié)，包括凋亡、細(xì)胞分化和分裂、脂代謝、造血和病毒防御等。有研究表明，miR-326能夠通過(guò)抑制Ets-1轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而促進(jìn)輔助性T細(xì)胞17(Th17)的

5、分化；并且miR-326表達(dá)水平與自身免疫性疾病的疾病活動(dòng)度顯著相關(guān)。而本課題組已通過(guò)前期研究證實(shí)，Th17及其相關(guān)細(xì)胞因子參與了SLE的發(fā)病，并首次提出Th17可能作為SLE的治療靶點(diǎn)。此外，課題組參與的兩項(xiàng)全基因組關(guān)聯(lián)研究已經(jīng)證實(shí)Ets-1是SLE的易感基因。由此，我們提出了Ets-1在SLE中可能的作用通路。據(jù)此推測(cè)miRNA可能通過(guò)調(diào)控一些關(guān)鍵的靶基因，從而在SLE的發(fā)病中起重要作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道多個(gè)miRNA與自身免疫性疾病有

6、關(guān)，它們是否也參與SLE的發(fā)病尚不清楚。
　　血漿miRNA具有含量豐富、性質(zhì)穩(wěn)定、易于檢測(cè)等特征，已作為一類新型生物標(biāo)志物用于腫瘤等慢性非傳染性疾病的早期篩查、診斷和預(yù)后評(píng)估研究，但在 SLE中多為在外周血單核細(xì)胞（PBMC）中的表達(dá)研究，對(duì) SLE患者血漿miRNA表達(dá)譜的報(bào)道較少。
　　近年有研究表明 microRNA-101通過(guò)靶向調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinas

7、es，MAPKs）mRNA的3’UTR區(qū)來(lái)控制MAPK的水平，同時(shí)影響其下游細(xì)胞因子的分泌。MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)眾多與SLE發(fā)病相關(guān)的細(xì)胞因子，例如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-a）、白細(xì)胞介素1（interleukin1，IL-1）、白細(xì)胞介素6（interleukin6，IL-6）和干擾素（interferon，IFN）等等，它們都在SLE的發(fā)病中都扮演著至關(guān)重要的角色。有研究顯示，

8、miRNA是通過(guò)結(jié)合靶mRNA的3'UTR區(qū)域從而實(shí)現(xiàn)對(duì)其表達(dá)的調(diào)控，無(wú)論是IL-6還是TNF-a，它們的3' UTR區(qū)域中都含有microRNA-16的結(jié)合位點(diǎn)。此外，許多研究均顯示microRNA-16的過(guò)表達(dá)會(huì)使IL-6、IL-8和TGF-β的表達(dá)量下降。因此，我們意圖通過(guò)ELISA檢測(cè)IL-6、IL-17和TNF-a的表達(dá)量是否與miR-16-5p和miR-101-3p的表達(dá)相關(guān)。
　　基于以上，本研究擬通過(guò)miRNA芯片

9、檢測(cè)SLE患者和正常對(duì)照血漿miRNA表達(dá)水平，并進(jìn)行獨(dú)立驗(yàn)證，結(jié)合人口統(tǒng)計(jì)學(xué)資料和臨床資料，建立 SLE及不同臨床亞型的血漿miRNA表達(dá)譜，初步探討相關(guān)miRNA在SLE發(fā)病中的分子機(jī)制。之后探討某些經(jīng)過(guò)驗(yàn)證異常表達(dá)的miRNAs與三種細(xì)胞因子IL-6、IL-17和TNF-α的相關(guān)。本研究的完成將有助于確定SLE診斷和疾病分型的生物學(xué)標(biāo)記，為最終發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)提供科學(xué)依據(jù)。
　　研究一、SLE患者血漿microRNA的差異表

10、達(dá)及驗(yàn)證
　　目的：
　　篩查并驗(yàn)證系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的血漿 microRNA表達(dá)譜，探討microRNA的表達(dá)與SLE發(fā)病及其病程的關(guān)聯(lián)性，為SLE的發(fā)病機(jī)制研究、早期預(yù)警、新的治療方向提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　本項(xiàng)目采用病例對(duì)照研究，通過(guò)收集 SLE患者和正常對(duì)照的血液標(biāo)本，利用miRNA芯片檢測(cè)其血漿miRNA表達(dá)水平，并利用Real-time PCR方法進(jìn)行獨(dú)立驗(yàn)證，結(jié)合人口統(tǒng)計(jì)學(xué)資料和臨床資料，建

11、立 SLE及不同臨床亞型的血漿miRNA表達(dá)譜，探討異常表達(dá)的 miRNAs與 SLE患者臨床特征間的關(guān)聯(lián)。從2012年10月開(kāi)始收集新發(fā)SLE病例的血液標(biāo)本備用。SLE病例主要來(lái)自于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科和安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院風(fēng)濕免疫科?；颊叻?997年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）的SLE分類標(biāo)準(zhǔn)；選擇年齡、性別與SLE患者匹配的正常人作為對(duì)照組。第一階段擬收集SLE新發(fā)病例和對(duì)照各30例，用于miRNA芯片檢測(cè)血漿中m

12、iRNA的表達(dá)水平；第二階段擬重新收集SLE新發(fā)病例38例和對(duì)照40例，進(jìn)行獨(dú)立驗(yàn)證。
　　miRNA芯片檢測(cè)數(shù)據(jù)使用GenePixpro6.0提取分析，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)使用Real-time PCR方法檢測(cè)miR-16-5p和miR-101-3p表達(dá)量，以2-ΔCt表示目的miRNA相對(duì)表達(dá)量。使用Epi Data3.1建庫(kù)，雙人錄入資料，專人抽查核實(shí)。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS10.01軟件進(jìn)行處理與統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

13、>　　結(jié)果：
　　（1）miRNA芯片的篩查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在SLE患者血漿中共篩選出97個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，182個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，最終篩選出差異表達(dá)的人類miRNAs有158個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)有32個(gè)基因，表達(dá)下調(diào)有126個(gè)基因。
　　（2）擴(kuò)大樣本量，設(shè)計(jì)引物對(duì)差異表達(dá)的人類 miRNAs其中的2個(gè)microRNAs:miR-16-5p和miR-101-3p在SLE患者和正常對(duì)照中的表達(dá)水平進(jìn)行Re

14、al-time PCR驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-16-5p和miR-101-3p在SLE患者血漿中的表達(dá)差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P分別為0.001和0.005），與 miRNA芯片篩查預(yù)測(cè)的結(jié)果一致。
　?。?）miR-16-5p和miR-101-3p血漿表達(dá)水平與SLE患者主要臨床特征和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)研究中，發(fā)現(xiàn)皮疹陽(yáng)性組與陰性組間、血小板降低組與非血小板降低組間的miR-16-5p和miR-101-3p表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

15、，統(tǒng)計(jì)量和P值分別為Z皮疹=-2.368，P皮疹=0.017；Z血小板降低=-2.146，P血小板降低=0.032和Z皮疹=-2.046，P皮疹=0.041；Z血小板降低=-2.180，P血小板降低=0.029。
　?。?）血漿中miR-16-5p和miR-101-3p的表達(dá)水平與SLE患者疾病活動(dòng)度的關(guān)聯(lián)研究，發(fā)現(xiàn)SLE患者疾病活動(dòng)度評(píng)分與miR-16-5p和miR-101-3p表達(dá)水平的相關(guān)性均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均有P＞0.05）

16、。
　?。?）SLE患者血漿中miR-16-5p、miR-101-3p表達(dá)水平的相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-16-5p表達(dá)水平與miR-101-3p表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.675，P<0.001）。
　　結(jié)論：
　　在 SLE患者血漿 miRNA芯片的篩查中，最終篩選出差異表達(dá)的人類miRNAs有158個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的有32個(gè)基因，表達(dá)下調(diào)有126個(gè)基因。對(duì)miR-16-5p、miR-101-3p的Real-tim

17、e PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果與芯片篩查結(jié)果相符。在對(duì)血漿miR-16-5p和miR-101-3p表達(dá)水平與SLE患者臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的分析中，顯示miR-16-5p和miR-101-3p的表達(dá)均與皮疹和血小板降低相關(guān)，提示這兩個(gè) miRNAs可以作為潛在的診斷、判斷疾病預(yù)后或是復(fù)發(fā)情況的分子標(biāo)志物。
　　研究二、SLE患者血漿中miR-16-5p和miR-101-3p表達(dá)水平與IL-6、IL-17和TNF-α水平的相關(guān)性研究

18、　　目的：
　　研究miR-16-5p和miR-101-3p在SLE患者血漿中的表達(dá)水平與IL-6、IL-17和TNF-α水平的關(guān)聯(lián)性，探討在 SLE發(fā)病及其病程發(fā)展中這3種細(xì)胞因子與miR-16-5p和miR-101-3p的相互作用。
　　方法：
　　研究對(duì)象 SLE患者的選取標(biāo)準(zhǔn)同研究一，與研究一來(lái)源于同一樣本人群。ELISA實(shí)驗(yàn)最終檢測(cè)的樣本量為37例患者。SLE患者資料收集的內(nèi)容和方法同研究一。在獲得研究對(duì)象知

19、情同意后，使用EDTA抗凝采血管抽取所有研究對(duì)象外周靜脈血5ml，3小時(shí)內(nèi)進(jìn)行分離血漿處理。同時(shí)由專業(yè)人員對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查，收集研究對(duì)象的一般情況和臨床資料，并進(jìn)行 SLE疾病活動(dòng)指數(shù)（systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI）評(píng)分。采用ELISA試劑盒檢測(cè)血漿中IL-6、IL-17和TNF-α的水平，對(duì)SLE患者中狼瘡腎炎患者和非狼瘡腎炎患者、疾病活動(dòng)期

20、患者和非疾病活動(dòng)期患者之間血漿IL-6、IL-17和TNF-α水平的差異及其與miR-16-5p和miR-101-3p在SLE患者血漿中表達(dá)水平的相關(guān)性進(jìn)行分析。采用SPSS10.01軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：
　?。?）SLE患者血漿中IL-6、IL-17和TNF-α的水平 IL-6的血漿濃度為（18.15±7.82）pg/mL，IL-17的血漿濃度為（20.42±10.11）pg/mL，TNF-

21、α的血漿濃度為（33.66±15.18）pg/mL。
　?。?）SLE患者血漿中IL-6、IL-17和TNF-α的水平與SLE患者主要臨床特征和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)的關(guān)聯(lián) SLE患者管型尿與非管型尿組間的血漿 IL-6水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.388，P=0.009）；肌炎和非肌炎組、血小板降低組和血小板未降低組間的血漿IL-17水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t肌炎=-5.354，P肌炎<0.001；t血小板降低=-2.267，P血小板降低

22、=0.030）；盤(pán)狀紅斑和非盤(pán)狀紅斑組間的TNF-α血漿水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.499，P<0.001）。
　?。?）SLE患者血漿中IL-6、IL-17和TNF-α血漿水平與SLE患者疾病活動(dòng)度的關(guān)聯(lián) SLE患者血漿IL-6、IL-17和TNF-α水平與其疾病活動(dòng)度的關(guān)聯(lián)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均有P＞0.05）。
　　（4）SLE患者血漿中IL-6、IL-17和TNF-α水平與miR-16-5p表達(dá)水平的相關(guān)性 SLE患者

23、血漿IL-6、IL-17和TNF-α水平與miR-16-5p表達(dá)水平的相關(guān)性均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均有P＞0.05）；不同臨床癥狀間、不同實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)間的比較顯示，SLE患者非顴部紅斑組血漿TNF-α水平與miR-16-5p表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.928，P<0.001），關(guān)節(jié)炎組（r=-0.486，P=0.014）、抗Ribosomal P陽(yáng)性組血漿TNF-α水平與miR-16-5p表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.488，P=0.047）。

24、
　?。?）SLE患者血漿中IL-6、IL-17和TNF-α水平與miR-101-3p表達(dá)水平的相關(guān)性 SLE患者血漿中miR-101-3p表達(dá)水平與 IL-17水平呈正相關(guān)（r=0.329,P=0.047）；盤(pán)狀紅斑陰性組、低補(bǔ)體陽(yáng)性組、抗核抗體陽(yáng)性組血漿IL-17水平與miR-101-3p表達(dá)水平呈正相關(guān)（均有P<0.05），管型尿陰性組、蛋白尿陰性組、膿尿陰性組、抗Ribosomal P陰性組IL-17血漿水平與miR-10

25、1-3p表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（均有P<0.05）；抗Ribosomal P陰性組血漿TNF-α水平與miR-101-3p表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.448，P=0.048）。
　　結(jié)論：
　　本研究發(fā)現(xiàn)SLE患者血漿IL-17水平與miR-101-3p表達(dá)水平相關(guān)，未發(fā)現(xiàn)SLE患者血漿IL-6、IL-17和TNF-α水平與miR-16-5p表達(dá)水平相關(guān)，但是血漿IL-6、IL-17和TNF-α水平與miR-16-5p和miR-10