Per2節(jié)律基因?qū)549肺癌細胞侵襲遷移能力的影響及其相關(guān)分子的實驗研究.pdf

1、研究背景肺癌是當(dāng)今世界發(fā)病率和病死率增長最快，對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤。轉(zhuǎn)移是肺癌的惡性標(biāo)志和特征，也是導(dǎo)致治療失敗和患者死亡的首要原因，約有30％的肺癌患者在首診時已有遠處轉(zhuǎn)移，另有50%～60%在治療過程中發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，80%～90%的肺癌死亡是由轉(zhuǎn)移引起[1,2]。而近年來時間生物學(xué)(Chronobiology)在肺癌研究領(lǐng)域的運用為我們揭示肺癌轉(zhuǎn)移的分子機制這一難題開辟新思路。生物鐘基因不僅參與調(diào)控正常細胞的各種生物學(xué)

2、行為，同樣也影響著腫瘤細胞的多種生物學(xué)行為，可能是一種腫瘤抑制基因。近年來生物鐘基因特別是Period基因已成為國內(nèi)外肺癌研究領(lǐng)域內(nèi)的一個新焦點[3-5]。研究提示Period基因參與了肺癌的發(fā)生、發(fā)展及細胞凋亡等多種生物學(xué)行為。目前已知可能抑制肺癌轉(zhuǎn)移的基因有CDH1，Nm23，KAI1和MTSl等。可能起促進肺癌轉(zhuǎn)移作用的基因有c-Myc，VEGF和CD44。但對于Period基因是否參與了對肺癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的調(diào)控，國內(nèi)外目前還沒有

3、相關(guān)研究。
　　目的探尋Per2基因在人肺癌中侵襲轉(zhuǎn)移方面的作用和意義。
　　方法體外實驗構(gòu)建真核表達載體pcDNA3.1（+）-Per2，慢病毒包裝，并采用慢病毒轉(zhuǎn)染人A549肺癌細胞，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的A549細胞株，RT-PCR和Western Blotting法鑒定過表達Per2基因表達。改良Boyden小室法和劃痕實驗法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞體外侵襲遷移能力的變化。RT-PCR和Western Blotting法檢測NM23

4、、VEGF、C-MYC、CDH1和CD44基因和蛋白的表達水平。體內(nèi)實驗：運用免疫組化技術(shù)檢測皮下移植瘤中Per2，Nm23和CDH1的表達水平。通過裸鼠尾靜脈注射穩(wěn)定轉(zhuǎn)染A549細胞，構(gòu)建裸鼠A549肺癌細胞侵襲遷移模型，解剖兩組裸鼠的腦、肺、肝和腎上腺組織，進行HE染色，進行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果體外實驗：RT-PCR實驗結(jié)果證實OE(over-expressed)組比NC(negative control)組Per2基因表達量

5、高出11倍。Western blotting結(jié)果也顯示OE組較NC組Per2基因表達量明顯提高，并通過灰度定量分析，兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0425）。體外侵襲和遷移實驗結(jié)果表明NC組細胞穿透小室的平均細胞數(shù)為134.2±7.165和130.8±9.987。OE組細胞穿透小室的平均細胞數(shù)為56.80±6.763和20.20±4.164,NC組明顯高于OE組（P＜0.0001和P＜0.0001）。劃痕實驗NC基因組細胞平均遷移距

6、離為452.8±5.279像素，OE細胞平均遷移距離315.4±5.743像素，兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.0001）。RT-PCR和Western blotting結(jié)果也表明OE組細胞的VEGF、CD44和c-Myc基因的表達和蛋白水平明顯低于NC組，CDH1和Nm23的表達水平明顯增高（P值均小于0.05）。體內(nèi)實驗：皮下移植瘤免疫組化發(fā)現(xiàn)：OE組中Nm23和CDH1的表達水平高于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0383和0

7、.0232）。
　　結(jié)論 Per2基因明顯降低了A549腫瘤細胞的侵襲遷移能力。Per2基因通過調(diào)節(jié)與腫瘤侵襲遷移相關(guān)基因來抑制A549腫瘤細胞侵襲遷移能力。其中，Per2基因下調(diào)A549細胞中的促腫瘤侵襲遷移相關(guān)基因，如VEGF、CD44和c-Myc基因的表達水平，上調(diào)抑腫瘤侵襲遷移相關(guān)基因，如Nm23和CDH1。本實驗為深入研究Per2基因影響肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制和信號通路奠定基礎(chǔ)，具有重要的理論意義，并可為肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的診