真菌疏水蛋白HGFI、HFBI的表達(dá)及其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能研究.pdf

1、真菌疏水蛋白是高等絲狀真菌在特定生理時(shí)期分泌產(chǎn)生的一類小分子量蛋白質(zhì)。經(jīng)研究分析發(fā)現(xiàn)這類蛋白質(zhì)具有很高的表面活性，能夠通過自組裝在兩相界面處形成兩性蛋白膜，從而改變原介質(zhì)表面的親/疏水性。根據(jù)水緣性圖譜和自組裝成蛋白膜后溶解度的不同，真菌疏水蛋白被分為Ⅰ型和Ⅱ型兩類。近些年真菌疏水蛋白在國際上得到了廣泛的應(yīng)用，其中主要包括在蛋白的固定化、分離技術(shù)、乳化劑、生物活性包被材料、生物傳感器和生物芯片等領(lǐng)域。但是對(duì)真菌疏水蛋白結(jié)構(gòu)方面的研究報(bào)道

2、很少，尤其是Ⅰ型疏水蛋白，由于其溶解度小獲得晶體難，所以對(duì)其結(jié)構(gòu)及由結(jié)構(gòu)決定的成膜性質(zhì)和吸附能力了解更少。
　　 根據(jù)計(jì)算機(jī)模擬及相關(guān)實(shí)驗(yàn)分析證實(shí)真菌疏水蛋白在固體表面固定化過程中，其N端是懸浮在蛋白表面的，對(duì)表面的親/疏水性影響較大;Ⅰ型真菌疏水蛋白中第三個(gè)和第四個(gè)半胱氨酸之間的氨基酸殘基形成的環(huán)在其自組裝過程中起到了關(guān)鍵作用，同時(shí)也可能是導(dǎo)致Ⅰ、Ⅱ型真菌疏水蛋白性質(zhì)差異的主要原因。但這些推測到目前都沒有得到很好的證實(shí)。

3、>　　 本研究以灰樹花Ⅰ型疏水蛋白HGFI、瑞氏木霉Ⅱ型疏水蛋白HFBI及其突變體和融合蛋白為研究對(duì)象，進(jìn)行了相關(guān)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)與功能的系列研究。
　　 在第二章中，進(jìn)行了Ⅱ型真菌疏水蛋白HFBI基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá)純化與性質(zhì)研究工作。通過構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9-hfb(I)并將其轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了HFBI在畢赤酵母中的成功表達(dá)。通過中空纖維膜超濾法和高壓液相色譜法對(duì)畢赤酵母表達(dá)的HFBI(rHFBI)實(shí)

4、現(xiàn)了很好的分離純化。接觸角測定和X-射線光電子能譜實(shí)驗(yàn)表明，重組rHFBI能夠很好地在疏水性的硅化玻璃和親水性的云母表面成膜。水油分散實(shí)驗(yàn)表明，與畢赤酵母表達(dá)的真菌Ⅰ型疏水蛋白rHGFI及常用的食品乳化劑酪蛋白酸鈉相比，Ⅱ型真菌疏水蛋白rHFBI具有更好的乳化能力，能更長久地穩(wěn)定油水混合系，使油滴不容易從水溶液中聚集析出，而發(fā)生分層現(xiàn)象。啤酒的gushing實(shí)驗(yàn)表明，與Ⅰ型真菌疏水蛋白rHGFI相比，Ⅱ型真菌疏水蛋白rHFBI在溶液中具

5、有更好的穩(wěn)定氣泡的能力，更適合作為啤酒爆瓶的指示劑。
　　 在第三章中，通過蛋白融合技術(shù)，將Ⅱ型疏水蛋白HFBI和Ⅰ型疏水蛋白HGFI中第三(C3)、第四(C4)兩個(gè)半胱氨酸之間的氨基酸殘基形成的環(huán)(C3-C4環(huán))進(jìn)行了互換，并將得到的突變體HGFI-AR（HGFI中的C3-C4環(huán)被HFBI中的C3-C4環(huán)所取代）和HFBI-AR（HFBI中的C3-C4環(huán)被HGFI中的C3-C4環(huán)所取代）在畢赤酵母中成功表達(dá)。將突變體蛋白進(jìn)行超

6、濾和高效液相分離純化后，分別利用水接觸角、X-射線光電子能譜、原子力顯微鏡、圓二色譜及ThioflavinT(ThT)和Congored(CR)熒光標(biāo)記技術(shù)對(duì)突變蛋白的分子結(jié)構(gòu)與性質(zhì)進(jìn)行了表征和分析。結(jié)果表明:第一，經(jīng)過大段環(huán)替換以后，突變體蛋白仍保持了疏水蛋白的特性-可以在兩相界面自組裝成兩性蛋白膜進(jìn)而改變界面的親/疏水性。但由于改變了原有疏水蛋白的親/疏水氨基酸殘基的組成，使得突變體蛋白改變固體表面的親/疏水能力發(fā)生了不同程度變化;

7、第二，Ⅰ型疏水蛋白rHGFI在空氣/水界面自組裝過程中伴有大量額外的β-片層結(jié)構(gòu)產(chǎn)生，使得其在圓二色譜中的吸收峰向β折疊區(qū)域移動(dòng)，熒光探針THT吸光值急劇增加以及CR吸收峰出現(xiàn)紅移現(xiàn)象;第三，C3-C4環(huán)在Ⅰ型真菌疏水蛋白rHGFI桿狀結(jié)構(gòu)形成過程中都起了至關(guān)重要的作用，但它不是rHGFI桿狀結(jié)構(gòu)形成過程中的唯一因素。
　　 在第四章中，通過構(gòu)建Ⅰ型真菌疏水蛋白HGFI與特異性黏附血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)功能小肽TPS(TPSL

8、EQRTVYAK)的融合表達(dá)載體pPIC9-tps-linker-hgf(I)(pPIC9-tlh)，成功的實(shí)現(xiàn)了在畢赤酵母中對(duì)融合蛋白HGFI-TPS(TLH)的表達(dá)。經(jīng)過對(duì)融合蛋白TLH進(jìn)行超濾和高效液相分離純化后，對(duì)其相關(guān)的生物學(xué)活性和功能進(jìn)行了后續(xù)的測定。
　　 接觸角和X-射線光電子能譜測定實(shí)驗(yàn)表明:TLH保持了真菌疏水蛋白HGFI的兩親性，能夠在疏水的聚已內(nèi)酯(PCL)表面自組裝成穩(wěn)定的蛋白膜。EPC細(xì)胞特異性黏附實(shí)

9、驗(yàn)表明:融合蛋白TLH保持了TPS原有的特異性-能夠很好的發(fā)揮其對(duì)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞特異性黏附的功能。
　　 在第五章中，通過熒光探針技術(shù)，對(duì)Ⅰ型真菌疏水蛋白rHGFI在不同條件下桿狀結(jié)構(gòu)的形成過程進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:第一，Ⅰ型疏水蛋白rHGFI在空氣/水界面自組裝成桿狀結(jié)構(gòu)的過程是疏水作用力和靜電力共同作用的結(jié)果，pH對(duì)疏水蛋白rHGFI自組裝成桿狀結(jié)構(gòu)的臨界濃度有很大影響，pH越靠近rHGFI的等電點(diǎn)濃度臨界值越小，越遠(yuǎn)離

10、等電點(diǎn)濃度臨界值越大;第二，溶液中不同的溶劑和溶質(zhì)添加物通過競爭性的降低液體表面張力，從而抑制Ⅰ型疏水蛋白rHGFI桿狀結(jié)構(gòu)的形成過程;第三，與Ⅱ型疏水蛋白HFBI的聚集過程不同，Ⅰ型疏水蛋白rHGFI在空氣/水界面自組裝成桿狀結(jié)構(gòu)的過程是一個(gè)有序的β-片層結(jié)構(gòu)增加的排列過程，而不是一個(gè)進(jìn)行簡單的堆積過程。最后，通過研究溫度對(duì)rHGFI在空氣/水界面自組裝成桿狀結(jié)構(gòu)過程的影響得出了:Ⅰ型疏水蛋白rHGFI桿狀結(jié)構(gòu)的形成過程不是自發(fā)的熵增