3D打印結(jié)構(gòu)性微環(huán)境調(diào)控表皮細胞分化為汗腺的效應研究.pdf

1、皮膚中所生長的汗腺組織具有重要的分泌汗液、排泄廢物的作用，對維持皮膚健康、機體體溫平衡尤為關(guān)鍵。一旦汗腺組織遭到大面積的破壞便會導致機體大量汗液排出體外障礙，所造成的缺陷將嚴重地影響患者的生活質(zhì)量。例如在炎熱氣候，體育鍛煉或發(fā)熱等情況下，如果汗腺功能失調(diào)可導致高體溫，中風，甚至死亡。皮膚損傷（包括燒傷、戰(zhàn)傷以及其它物理與化學等因素造成的損傷）也會導致汗腺功能受損，盡管目前我國燒傷早期救治處于國際領(lǐng)先水平，但令人遺憾的是存活患者皮膚多為瘢

2、痕修復，皮膚附件如汗腺、毛囊以及皮脂腺等缺乏的問題尚待解決，因而并不能算是真正意義上的修復與再生。目前，基于小鼠汗腺模型的研究表明在足趾墊部分存在有助于創(chuàng)面修復的干細胞群。然而，這些汗腺細胞修復活動的分子機制以及在重度皮膚損傷累及汗腺的情況下還能否發(fā)揮其修復功能等問題上還是未知數(shù)。在這種創(chuàng)傷條件下，遭創(chuàng)區(qū)域的全層皮膚組織結(jié)構(gòu)都已遭到破壞，汗腺組織的嚴重結(jié)構(gòu)性毀損必將形成，依賴自身原位細胞的分裂、增殖與分化來實現(xiàn)復雜結(jié)構(gòu)的重建顯得尤為困難

3、，而且有研究表明創(chuàng)面周邊的正常汗腺細胞在創(chuàng)面修復過程中呈靜息狀態(tài)，因此很難使其自行趨化至創(chuàng)面修復已缺損汗腺的功能。汗腺的再生將有效地提高損傷修復過程中局部皮膚組織的環(huán)境適應能力，更重要的是最終能恢復患者正常的排汗功能。汗腺再生的縱深研究能夠為提高創(chuàng)傷救治及愈合的質(zhì)量提供更多強力的支撐，因此具有急迫的臨床需求。
　　汗腺和其他皮膚附件一樣是由表皮前體細胞自胚胎期分化形成。然而，不同于已為人熟知的毛囊、皮脂腺等其他表皮衍生物，關(guān)于汗腺

4、的研究十分有限。但目前可以確定的觀點均認為表皮來源的干細胞/祖細胞仍是最具代表性且最有希望的再生汗腺種子細胞。然而多向分化潛能是表皮干（祖）細胞的突出特性，要實現(xiàn)其往汗腺定向分化需要構(gòu)造出特定的微環(huán)境。不同組的研究結(jié)果共同發(fā)現(xiàn)，汗腺的萌發(fā)生長依賴于表皮的基底膜區(qū)生理性穩(wěn)定以及真皮-表皮間的相互作用，其中汗腺生長周圍的細胞外基質(zhì)(ECM)是重要因素之一。ECM成分作為具有生物作用的功能活性區(qū)域，發(fā)揮與細胞的定向分化緊密關(guān)聯(lián)的作用。ECM內(nèi)

5、容不僅能夠引導內(nèi)在細胞的表型發(fā)生改變，而且可通過自身動態(tài)的結(jié)構(gòu)改建與活性改變來影響內(nèi)在細胞的生物學行為及細胞命運。另外，許多種類的細胞因子或生長因子如表皮生長因子(EGF)、骨形成蛋白-4(BMP-4)等的作用都證實能夠發(fā)揮生物學作用影響汗腺的發(fā)生與功能。我們所在的研究小組也在汗腺發(fā)育基因表達規(guī)律、汗腺主要標志物鑒別等方面進行了前期研究?，F(xiàn)有結(jié)果表明，汗腺細胞的增殖、分化和汗腺形態(tài)發(fā)生受到多種信號分子、生長因子和ECM成分的調(diào)控。鑒于這

6、些發(fā)現(xiàn)，汗腺發(fā)生區(qū)域真皮組分和生長因子是ECM中決定表皮祖細胞命運最為至關(guān)重要的因素。
　　近年來，隨著生物材料在組織工程和再生醫(yī)學領(lǐng)域的普及應用，在體外建立適合干細胞生長并影響其生物學行為的微環(huán)境成為可能。在眾多發(fā)展起來的及發(fā)展中的生物材料與組織工程新生技術(shù)中，3D生物打印技術(shù)因具有多方面的優(yōu)勢而獲得重視并得到廣泛應用。以往細胞生長在平坦表面形態(tài)的二維結(jié)構(gòu)中會失去其在組織中的基本功能并表現(xiàn)出不同形態(tài)，而且細胞間、細胞與基質(zhì)間的相

7、互作用也與體內(nèi)大不相同。而3D生物打印技術(shù)既能克服如此不足，彌補調(diào)控在空間上的缺陷，給細胞提供更多足夠的活動空間，而且還有利于血管和神經(jīng)的爬布生長，從而更好更完整地模擬出細胞的自然微環(huán)境(niche)，進而促細胞增殖、分化。尤其突出的是，3D生物打印技術(shù)具有高精度和構(gòu)建速度快的特點，不僅可以在三維層面確保不同種類細胞、細胞外基質(zhì)和生物活性因子的位置和分布的準確性，而且異質(zhì)的種子細胞和支架材料加入到同步的3D打印體系則能更利于整體三維結(jié)構(gòu)

8、的構(gòu)建。盡管按照目前的技術(shù)水準及制作工藝，利用3D打印技術(shù)所構(gòu)建出的三維組織結(jié)構(gòu)仍較為簡單，但3D生物打印技術(shù)在組織工程中應用的可行性已經(jīng)足以現(xiàn)有的研究工作所證實，這一點在本人所在實驗室小組的前期研究中已經(jīng)得到證實?；?D生物打印基礎(chǔ)構(gòu)建的天然材料基質(zhì)復合生長因子以及真皮基質(zhì)成分后，能夠最大限度地模擬出誘導表皮來源的祖細胞定向分化為汗腺細胞的微環(huán)境，而移植于皮膚全層缺損的創(chuàng)面后能夠促進皮膚創(chuàng)面的愈合，再生出汗腺組織。如通過設(shè)計將以上新

9、技術(shù)進一步優(yōu)化并合理應用于汗腺再生研究，有望真正實現(xiàn)汗腺再生治療的臨床轉(zhuǎn)化，并為新時期下的再生醫(yī)學研究提供更具有效性的以及個性化需求的創(chuàng)新策略。
　　目的:
　　該研究的目的和設(shè)計是建立基于3D生物打印平臺的、具有誘導表皮祖細胞定向分化為汗腺細胞潛在能力的優(yōu)化方案，并由此探討其分化過程中打印結(jié)構(gòu)對汗腺再生效果的影響和作用機制，使其更有利于實現(xiàn)向汗腺再生研究的臨床轉(zhuǎn)化。
　　方法:
　　1.表皮祖細胞培養(yǎng)和鑒定:首

10、先從出生前12.5天(E12.5)雌性GFP-C57/B16小鼠(Jackson Laboratory)的背部皮膚中獲取表皮干細胞，采用本研究小組所在實驗室已較成熟的培養(yǎng)系統(tǒng)，對表皮祖（干）細胞進行培養(yǎng)擴增及鑒定。2.真皮基質(zhì)成分獲取:去除毛發(fā)后從野生C57/B16小鼠的足趾墊區(qū)（汗腺發(fā)生的微環(huán)境）獲取真皮并制成真皮基質(zhì)勻漿(PD)，同時獲取小鼠背側(cè)真皮基質(zhì)（非汗腺發(fā)生的微環(huán)境）勻漿作為對照(DD)。3.生物打印油墨(bioink)制備

11、以及打印過程:通過3D生物打印機（Regenovo3D生物打印機，中國）突出的3D快速成型技術(shù)，按照1∶9的比例將1ml富集的表皮祖細胞懸液(1×107cell/ml)和真皮基質(zhì)勻漿(1ml)，加入到20％的明膠(12ml)和4％的海藻酸鈉(6ml)的混合水凝膠中，將上述混合成分封裝入事先消毒好的兩種不同打印直徑（300μm、400μm）的打印容器中按照設(shè)計的模型打印出多孔性三維結(jié)構(gòu)體。打印樣品用熒光顯微鏡進行原位的觀察。4.細胞活性和

12、生長因子釋放活性檢測:活細胞計數(shù)法原位分層檢測體外培養(yǎng)1-14天過程中模型中細胞的增殖以及活性。已有研究證明，真皮基質(zhì)成分中BMP-4的含量在表皮系細胞向汗腺分化過程中起重要調(diào)控作用。而在本研究中，隨打印墨水中明膠成分的降解，誘導成分中BMP-4也會隨之釋放。因此，用HE染色法檢測降解水平并用酶聯(lián)免疫測定法(Elisa)法檢測1-14天打印體所釋放的BMP-4濃度。5.細胞定向分化能力檢測:培養(yǎng)1-14天后檢測模型固定并制成切片做免疫組

13、化染色，檢測細胞的表皮基底細胞角蛋白CK5，CK14和汗腺管腔細胞角蛋白CK18，CK19的蛋白表達水平。培養(yǎng)1-28天后觀察打印體中的汗腺組織形成情況。
　　結(jié)果:
　　本研究建立的基于兩種不同打印直徑（300μm、400μm）打印噴頭的多孔性打印體在孔徑大小以及空間微結(jié)構(gòu)上有所區(qū)別，但所有打印模型中各層均可保持細胞活力且細胞分布較為均勻，具有可重復性和均一性。復合PD組所打印的3D細胞外基質(zhì)在細胞增殖、降解效果以及BMP

14、-4釋放等特性上無顯著差異，且均可以誘導表皮祖細胞向汗腺分化。但是，與400μm組相比，300μm噴頭復合PD組（300μm&PD+）打印出的3D細胞外基質(zhì)中細胞密度更高且在更短時間內(nèi)出現(xiàn)了汗腺細胞標志物的強表達。更為顯著的是，300μm&PD+組是唯一能夠觀察到明顯汗腺組織形態(tài)發(fā)生的打印模型，而其余組均未見明顯汗腺組織形成。將已經(jīng)分化的汗腺細胞或者形成的汗腺組織脫離開3D打印結(jié)構(gòu)進行2D培養(yǎng)后則發(fā)現(xiàn)細胞分化終止或不再形成組織。

15、　　結(jié)論:
　　本研究立足于以發(fā)展成熟的應用基礎(chǔ)學科（組織工程、生物材料）為基礎(chǔ)，結(jié)合3D生物打印的創(chuàng)新技術(shù)平臺，模擬構(gòu)建使表皮干細胞能定向分化為汗腺的微環(huán)境模型，在時間空間點的可控性和直觀性上為體外汗腺再生研究提供了良好基礎(chǔ);同時3D生物打印技術(shù)也優(yōu)化了模型構(gòu)建模式，使其比傳統(tǒng)組織工程模式更具科學性和應用價值。此外，本研究是在對汗腺發(fā)生發(fā)育的基本規(guī)律和形態(tài)結(jié)構(gòu)認識的基礎(chǔ)上，依托3D生物打印技術(shù)實施完成的，前期研究的基礎(chǔ)已經(jīng)為探討

16、3D生物打印皮膚微環(huán)境對表皮干細胞的定向誘導分化的關(guān)鍵作用研究提供了可靠的證據(jù)。本研究也再次明確了表皮來源的成體干細胞可借由3D打印的特定微環(huán)境用有效的分化為汗腺細胞。更為重要的是，本研究結(jié)果充分證明了3D生物打印的多孔狀結(jié)構(gòu)對表皮祖細胞向汗腺的的分化乃至汗腺組織的形成具有實質(zhì)性的作用，這不僅是為探索汗腺再生機理和功能重建提供了全新的研究策略，也為探討3D打印的空間結(jié)構(gòu)對細胞生物學特性的影響以及誘導組織再生的基礎(chǔ)研究奠定了堅實的實驗依據(jù)