ADAM10促進肺腺癌細胞順鉑化療耐藥.pdf

1、目的：
　　迄今為止，癌癥仍然是世界性難題，如今雖然在癌癥的治療方面已取得很大進步，特別是對肺癌的治療，但那些伴有侵略性非小細胞肺癌(NSCLC)的預(yù)后仍然不良。晚期NSCLC的治療主要依靠以鉑劑為主的雙重化療，遺憾的是其只有20％的應(yīng)答率。對化療反應(yīng)不佳多是因為癌細胞的多藥耐藥性(MDR)，尤其是對于順鉑的耐藥。因此，攻克化療耐藥問題迫在眉睫。
　　解聚素及金屬蛋白酶10，亦稱ADAM10或CDw156或CD156c，在人

2、類中是由ADAM10基因所編碼的蛋白質(zhì)。ADAM10經(jīng)由Notch1信號傳導(dǎo)途徑的活化促進非小細胞肺癌的遷移和侵襲。ADAM10在膀胱癌細胞中促進細胞增殖、侵襲，提高細胞對化療藥物的耐性。那么在NSCLC中ADAM10是否與順鉑化療耐藥有關(guān)呢？
　　方法：
　　1、細胞培養(yǎng)與si RNA干擾
　　本實驗頻繁采用的A549、A549/DDP、H1299細胞系均用RPMI1640液體培養(yǎng)基，在實驗室標準細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。A

3、DAM10 siRNA(h)和control siRNA購自Santa。將培養(yǎng)瓶內(nèi)長滿的細胞重新鋪于6孔板中，次日采用lipo3000試劑進行干擾，6小時后換液繼續(xù)培養(yǎng)，兩天后免疫印跡實驗檢測目的基因蛋白含量。
　　2、細胞生長抑制實驗
　　將狀態(tài)良好且已經(jīng)長滿的細胞計數(shù)，重新置于96孔板中（4000/孔），待細胞貼壁且狀態(tài)穩(wěn)定后加入梯度濃度的順鉑，設(shè)五個重復(fù)實驗組，48h后避光每孔加入MTT溶液，4h后加入DMSO，搖勻使

4、其充分溶解，最后Model550酶標儀測定每一個實驗組的OD值，數(shù)據(jù)處理時舍棄兩個離均的OD值，剩余的三個OD值用于計算結(jié)果。
　　3、Western Blot
　　將六孔板中長滿且狀態(tài)佳的細胞收集，在冰上操作，加入預(yù)冷的裂解液30分鐘后，離心，保留上清液。配制蛋白樣，設(shè)置上樣量為60μ g。電泳分離后，將膠質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)印完畢用專用封閉液封閉2h，4℃冰箱里一抗孵育，第二天將其分別與對應(yīng)的二抗孵育2h，ECL顯色

5、，最后采集結(jié)果。
　　4、提取RNA及Real-time RT-PCR
　　ADAM10 siRNA干擾組與對照組分別用PBS清洗1次，RNASio plus裂解細胞，加入氯仿，離心，取上清，加入異丙醇，高速低溫離心，保留沉淀，再加入乙醇（濃度為75％），高速低溫離心，棄乙醇，RNase-free水溶解沉淀物。測濃度，使3μ l液體中含有1800ng RNA。Real-time RT-PCR在7900實時定量PCR系統(tǒng)中完成

6、。
　　ADAM10，forward5'GAGGAGTGTACGTGTGCCAGTT-3'reverse5'GACCCCTGAAGTGCCTACTCCA-3'
　　5、流式細胞凋亡檢測實驗
　　采用AnnexinⅤ/PI試劑檢測細胞凋亡率，順鉑處理細胞48h，Binding Buffer懸浮細胞，加入Annexin-Ⅴ-FITC，再移至避光環(huán)境下加入碘化丙錠PI（最終濃度為1μg/ml）移液槍吹打混勻，1小時內(nèi)完成實驗

7、結(jié)果檢測。
　　6、免疫熒光實驗
　　24孔板中培養(yǎng)細胞，24h后用4％多聚甲醛固定細胞，再用5％BSA封閉細胞1小時，ADAM10抗體孵育，置于水浴盒中，儲存于4℃冰箱，第二天二抗避光孵育，2h后DAPI染核，避光環(huán)境下40％的甘油封片。倒置顯微鏡下觀察實驗結(jié)果。
　　7、統(tǒng)計方法
　　采用GraphPad Prism5統(tǒng)計分析軟件，通過獨立樣本t檢驗和單因素方差分析(ANOVA)進行統(tǒng)計學(xué)分析，以P＜0.05