酵母展示IGRP206-214H-2Kd單鏈三聚體對特異性CD8+T細胞的影響.pdf

1、1型糖尿病(Type1 diabetes mellitus，T1DM)又稱胰島素依賴型糖尿病，是由T淋巴細胞介導(dǎo)的對胰島β細胞破壞，導(dǎo)致胰島β細胞死亡的自身免疫病。CD8+細胞毒T細胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs)作為直接破壞者，在T1DM的發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要作用。Ⅰ型糖尿病模型鼠（NOD小鼠）發(fā)病早期體內(nèi)存在能特異性識別胰島β細胞上的葡萄糖-6-磷酸酶催化亞基相關(guān)蛋白（IGRP）抗原表位(206-2

2、14)的CD8+T細胞，并形成特異性結(jié)合的T細胞群。隨著病情的發(fā)展，IGRP特異性CTL細胞數(shù)量在發(fā)病15周達到高峰。
　　表面展示技術(shù)是以融合蛋白的形式將外源多肽展示在核糖體、病毒或細胞表面，但仍然能夠保持其相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，從而研究多肽的性質(zhì)、相互識別和作用。在蛋白質(zhì)工程中，表面展示技術(shù)是一種在環(huán)境生物修復(fù)，生物催化等多方面得到應(yīng)用的基因操作技術(shù)，同時還應(yīng)用于疫苗和治療藥物的開發(fā)等方面。酵母是真核生物，具有折疊酶、

3、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、分子伴侶等，在蛋白質(zhì)的折疊和分泌機制等方面與細菌展示技術(shù)相比更類似于哺乳動物。基于此建立起來的酵母表面展示技術(shù)可用于展示需要糖基化和二硫鍵異構(gòu)化等修飾的真核生物蛋白質(zhì)。本實驗室前期將MHCⅠ類分子的重鏈，β2微球蛋白(β2m)及抗原肽用接頭(linker)連接成單鏈三聚體(SCT)，通過與AGA2連接構(gòu)建成IGRP206-214H-2Kd-SCT的真核載體。
　　目的:本文章通過研究酵母表面展示的IGRP206-214H-

4、2Kd單鏈三聚體對NOD小鼠CD8+T細胞的影響，從而闡明胰島細胞特異性葡萄糖-6-磷酸催化亞基相關(guān)蛋白(IGRP)導(dǎo)致TID發(fā)病的機理。
　　方法:本實驗室前期已成功構(gòu)建真核表達型IGRP206-214H-2Kd單鏈三聚體及IGRP206-214H-2Kd單鏈三聚體的真核酵母表達載體。在此基礎(chǔ)上，通過篩選高表達IGRP206-214H-2Kd單鏈三聚體的酵母菌，進而研究酵母表面展示IGRP206-214H-2Kd單鏈三聚體對NO

5、D小鼠CD8+T細胞的影響。
　　結(jié)果:轉(zhuǎn)染了IGRP206-214H-2Kd單鏈三聚體的真核表達載體的酵母菌，在含2％D-半乳糖的酵母培養(yǎng)基中，20℃誘導(dǎo)18h，有77.1％的酵母能穩(wěn)定表達IGRP206-214H-2Kd單鏈三聚體蛋白。在體外試驗中與NOD鼠脾臟細胞共培養(yǎng)24小時CD69+表達量最高，占CD8+T細胞的1.89％;共培養(yǎng)96小時，CD25+表達量最高，占CD8+T細胞的4.25％。表明表達IGRP206-214