LGL1基因在小鼠嗅球發(fā)育中的功能研究.pdf

1、目的：
　　本試驗(yàn)利用小鼠的條件性基因敲除技術(shù)，獲得LGL1嗅球特異性敲除小鼠，即Pax2-LGL1條件敲除小鼠。利用這一條件性敲除的小鼠動(dòng)物模型，我們研究了LGL1基因在嗅球發(fā)育過(guò)程中的重要生物學(xué)功能及對(duì)嗅覺(jué)信號(hào)傳導(dǎo)的可能影響機(jī)制。擬解決的科學(xué)問(wèn)題為:(1)LGL1在小鼠嗅球發(fā)育中的作用;(2)LGL1影響嗅覺(jué)信息傳導(dǎo)的可能機(jī)制;(3)LGL1在調(diào)節(jié)嗅球神經(jīng)元遷移和定位的可能分子機(jī)制。
　　方法及結(jié)果：
　　本論文為

2、了解決上述科學(xué)問(wèn)題，以小鼠為實(shí)驗(yàn)材料，利用Cre-LoxP系統(tǒng)，首先制作了在嗅球中特異性敲除LGL1基因的小鼠模型，由于More-Cre介導(dǎo)的LGL1基因敲除小鼠在出生后24時(shí)致死，因此，我們采用Pax2-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠在小鼠嗅球中特異性敲除LGL1，所得到的Pax2-LGL1條件敲除小鼠可成功存活至成體。在本論文中，我們利用Pax2-LGL1條件敲除小鼠研究了LGL1基因組嗅球發(fā)育過(guò)程中的重要作用。
　　Pax2-Cre表達(dá)時(shí)

3、間較早，大約在胚胎期E7.5天時(shí)將LGL1基因在嗅球中特異性敲除。在研究中，我們發(fā)現(xiàn)，LGL1基因條件敲除小鼠可以存活到成體，但同野生型小鼠相比，LGL1基因敲除的純合型小鼠在個(gè)體大小和嗅球形態(tài)上存在明顯的發(fā)育異常。Pax2-LGL1條件敲除小鼠體型和嗅球均較小，且存在水腫現(xiàn)象。對(duì)野生型和純合型小鼠的體重跟蹤稱量發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，純合型小鼠的體重明顯減輕。同時(shí)，對(duì)嗅球背部表面積的測(cè)量表明，純合型小鼠的嗅球表面積明顯變小。
　

4、　為了研究LGL1基因敲除對(duì)小鼠嗅覺(jué)功能的影響，我們分別采用了經(jīng)典的行為學(xué)試驗(yàn)“食物包埋試驗(yàn)”和“嗅迷宮試驗(yàn)”對(duì)小鼠的嗅覺(jué)功能進(jìn)行了檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果表明在“食物包埋試驗(yàn)”和“嗅迷宮試驗(yàn)”中，純合型小鼠尋找食物所用的時(shí)間明顯大于野生型小鼠。這也揭示LGL1在小鼠嗅球中的特異性敲除不僅影響了小鼠體型和嗅球形態(tài)的正常發(fā)育，同時(shí)也對(duì)小鼠嗅功能的正常發(fā)揮產(chǎn)生了重要的影響。
　　小鼠嗅球結(jié)構(gòu)在進(jìn)化上具有高度保守的層狀結(jié)構(gòu)，我們進(jìn)一步對(duì)嗅球的形態(tài)

5、結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，在野生型小鼠發(fā)育過(guò)程中，嗅球的層狀結(jié)構(gòu)清晰，各層神經(jīng)元排列穩(wěn)定有序，而在Pax2-LGL1條件敲除的純合型小鼠發(fā)育過(guò)程中，嗅球?qū)訝罱Y(jié)構(gòu)模糊，神經(jīng)元排列紊亂，并在嗅周球細(xì)胞層和僧帽狀細(xì)胞層中出現(xiàn)了層狀結(jié)構(gòu)異常以及神經(jīng)元缺失的現(xiàn)象。因此，我們提出在小鼠嗅球發(fā)育的過(guò)程中，LGL1基因?qū)π∈笮崆蛘訝罱Y(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定，神經(jīng)元的定位和分布起重要作用。
　　雖然小鼠嗅球結(jié)構(gòu)在進(jìn)化上具有高度保守的層狀結(jié)構(gòu)，但是各層狀

6、結(jié)構(gòu)的特征性神經(jīng)元卻并不完全相同，所以可以利用不同的神經(jīng)元標(biāo)記分子對(duì)嗅球中各層中的特征性神經(jīng)元進(jìn)行標(biāo)記、觀察。我們首先研究了LGL1基因缺失對(duì)SP8標(biāo)記的中間神經(jīng)元的影響。轉(zhuǎn)錄因子SP8是SP1鋅指蛋白家族成員，在小鼠嗅球的多巴胺能/非多巴胺能和鈣網(wǎng)膜蛋白中間神經(jīng)元都能夠表達(dá)。SP8的免疫熒光標(biāo)記結(jié)果顯示，在成熟的小鼠嗅球中，野生型小鼠嗅周球細(xì)胞層中SP8陽(yáng)性中間神經(jīng)元排列緊密有序，但在Pax2-LGL1條件敲除的純合型小鼠中，SP8陽(yáng)

7、性中間神經(jīng)元排列紊亂甚至缺失。然而進(jìn)一步的Western blotting結(jié)果顯示，LGL1條件敲除的純合型小鼠中嗅球中SP8的表達(dá)水平并沒(méi)有出現(xiàn)明顯的下降。這一結(jié)果說(shuō)明，LGL1缺失可能并沒(méi)有導(dǎo)致嗅球中SP8陽(yáng)性中間神經(jīng)元數(shù)量的明顯下降，但在引導(dǎo)SP8陽(yáng)性中間神經(jīng)元的定位和分布中起重要作用。
　　接下來(lái)我們對(duì)中間神經(jīng)元的亞型鈣結(jié)合蛋白中間神經(jīng)元進(jìn)行了檢測(cè)。通過(guò)Calbidin D28k的免疫熒光染色顯示，同野生型小鼠相比，純合型

8、小鼠鈣結(jié)合蛋白陽(yáng)性中間神經(jīng)元層明顯變窄，排列紊亂并且數(shù)目減少，表達(dá)水平降低。
　　嗅球僧帽狀細(xì)胞是調(diào)控嗅覺(jué)信號(hào)向大腦傳導(dǎo)的刺激和選擇特異性的重要神經(jīng)元，同時(shí)也是副嗅球(accessory olfactory bulb，AOB)的主要功能性神經(jīng)元之一。在試驗(yàn)中我們研究了Tbx21標(biāo)記的位于僧帽狀細(xì)胞層的特征性紋狀神經(jīng)元僧帽細(xì)胞(mitral cells，MCs)。通過(guò)Tbx21的免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在小鼠嗅球發(fā)育過(guò)程中，相比于野生型小

9、鼠的嗅球，純合型小鼠嗅球的僧帽狀細(xì)胞層寬度明顯變小，其中的MCs紋狀神經(jīng)元隨著嗅球的發(fā)育成熟，逐漸變少，排列紊亂。并且對(duì)AOB的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，純合型小鼠的AOB明顯變小，MCs紋狀神經(jīng)元數(shù)目同樣明顯減少。
　　本課題中我們主要研究了在LGL1在嗅球小鼠嗅球形成和發(fā)育過(guò)程中，對(duì)其發(fā)育調(diào)控的重要功能及可能的分子機(jī)制。嗅球是生物體認(rèn)知的重要功能性器官，也是神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，參與更高水平的功能，包括情感，種群信息交流以及運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)等能力。

10、在本論文中，我們首先采用了經(jīng)典的嗅覺(jué)檢測(cè)的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，包括食物包埋試驗(yàn)和嗅迷宮試驗(yàn)，檢測(cè)了Pax2-LGL1條件敲除小鼠的嗅覺(jué)變化情況。結(jié)果顯示Pax2-LGL1條件敲除小鼠的尋找食物能力明顯下降。與成熟的野生型小鼠嗅球相比，Pax2-LGL1條件敲除小鼠的體型和嗅球明顯減小，并出現(xiàn)了輕微的水腫現(xiàn)象，嗅球中的中間神經(jīng)元和紋狀神經(jīng)元的發(fā)育明顯出現(xiàn)異常，神經(jīng)元分布紊亂，表達(dá)水平降低。
　　意義：
　　本論文利用LGL1特異性敲除

11、小鼠模型，闡明了LGL1基因在小鼠嗅球形成和發(fā)育過(guò)程中的重要功能，從細(xì)胞水平和分子水平上揭示了LGL1調(diào)節(jié)嗅球發(fā)育和神經(jīng)元遷移的可能機(jī)制，為進(jìn)一步研究高等動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育提供了理論基礎(chǔ)。此外，神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，尤其AD隨著社會(huì)人口老齡化程度的加劇，越來(lái)越常見(jiàn)，并且在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域還沒(méi)有找到真正的病因和治愈方法。由于嗅覺(jué)障礙被發(fā)現(xiàn)作為AD患者初期的臨床主要癥狀之一，因此，對(duì)嗅球發(fā)育及嗅覺(jué)信號(hào)傳導(dǎo)的研究能夠在一定程度上推動(dòng)了諸如AD等神經(jīng)性疾

12、病臨床診斷治療的發(fā)展。
　　本研究制作的Pax2-LGL1條件敲除小鼠可以存活至成體，并作為理想的人類(lèi)疾病的動(dòng)物模型，不僅為臨床診斷和治療提供理論基礎(chǔ)，同樣可以為高等動(dòng)物認(rèn)知障礙和嗅覺(jué)相關(guān)疾病的治療提供新的思路，具有一定的指導(dǎo)意義。我們可以從神經(jīng)性疾病患者中，特別是AD病人中檢測(cè)是否存在LGL1基因的突變，可能為以后藥物靶向位點(diǎn)的設(shè)計(jì)和神經(jīng)相關(guān)性疾病的治療提供理論基礎(chǔ)。因此，我們的研究成果不僅為嗅球發(fā)育的基礎(chǔ)研究填補(bǔ)了一定的空白，