FoxO3基因在斑馬魚胚胎神經(jīng)發(fā)育中的功能研究.pdf

1、胚胎發(fā)育過程中,神經(jīng)發(fā)育是一個很復(fù)雜的事件,包括各種信號傳導(dǎo)的相互作用。本課題以斑馬魚的胚胎發(fā)育系統(tǒng)作為模型,采用“功能缺失”和“功能獲得”的方法初步研究了FoxO3在胚胎神經(jīng)發(fā)育過程的功能作用。
　　 FoxO3是叉頭盒(forkhead)轉(zhuǎn)錄因子中O亞家族成員,在生物體內(nèi)參與多種生理調(diào)控作用,包括糖代謝、細胞增殖、細胞周期阻滯、壓力耐受性、生物長壽控制及細胞凋亡等。然而,并不清楚其是否參與胚胎神經(jīng)發(fā)育。
　　 首先,

2、通過RT-PCR、整胚原位雜交及免疫組化方法檢測了斑馬魚FoxO3a基因的組織表達特征及胚胎發(fā)育時期的時空表達方式。結(jié)果顯示:FoxO3a在斑馬魚成體組織如腦、眼、肝、鰓、卵巢、精巢、腸、心臟、脾臟都有表達而在肌肉和鰾不能或極微弱表達；在胚胎發(fā)育時期中,FoxO3a的轉(zhuǎn)錄本最早出現(xiàn)于卵裂早期(1-8細胞期),隨后在囊胚晚期(4 hpf)上升到較高水平,且在受精后4-8小時間保持一個較高的表達。其后,表達逐漸下降并維持一個相對較低水平；為

3、了確定FoxO3a在胚胎中的表達部位,進行了不同發(fā)育時期的胚胎整胚原位雜交和免疫組化實驗,結(jié)果顯示:FoxO3a主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)中表達,尤其在前腦、中腦、中后腦邊界、后腦及視網(wǎng)膜部位表達更加明顯。
　　 采用反義morpholino(MO)敲降技術(shù),斑馬魚FoxO3a被8ng FoxO3a-MO的敲降可引起胚胎神經(jīng)發(fā)育的缺陷,且異常可被FoxO3a mRNA顯微注射挽救。通過吖啶橙(acridine orange,AO)和TU

4、NEL檢測進一步證明FoxO3a的敲降誘導(dǎo)了一個增加的神經(jīng)凋亡；采用熒光定量PCR和胚胎原位雜交方法進一步檢測發(fā)現(xiàn):FoxO3a的敲降導(dǎo)致胚胎發(fā)育晚期神經(jīng)分子標志物表達下調(diào)且改變了凋亡相關(guān)分子的表達。
　　 為了進一步研究FoxO3a調(diào)控胚胎神經(jīng)發(fā)育的分子機制,構(gòu)建了FoxO3a-A3突變體(將可能受PI3k/Akt信號磷酸化調(diào)控的三個保守的Ser/Thr位點分別用Ala替換)。比較分析了過量表達FoxO3a-A3突變體mRNA

5、與FoxO3a mRNA后的胚胎發(fā)育表型,結(jié)果顯示,400 Pg FoxO3a—A3 mRNA顯微注射后的胚胎死亡數(shù)目高于同劑量FoxO3a mRNA注射對照組。
　　 對脊椎動物FoxO家族蛋白同源進化分析表明:在斑馬魚中存在兩個與哺乳動物FoxO3a同源的蛋白(FoxO3a與FoxO3b)。因此,還檢測了斑馬魚FoxO3b胚胎時空表達模式,結(jié)果顯示,FoxO3b與FoxO3a都集中在神經(jīng)系統(tǒng)部位表達。
　　 對Fox

6、O3b進行反義MO敲降,結(jié)果表明,6 ng FoxO3b—MO注射引起相似于FoxO3a敲低后的表型異常。最后,當共注射FoxO3b-MO與FoxO3a—MO時,則僅需4 ng混合MOs(2ng Foxo3a-MO+2 ng Foxo3b-MO)導(dǎo)致胚胎神經(jīng)發(fā)育缺陷。進而通過熒光定量PCR法進一步檢測發(fā)現(xiàn)FoxO3a與FoxO3b共敲降后顯著抑制了神經(jīng)分子標志物的表達,且誘導(dǎo)了凋亡基因Bim的強烈表達。最后,采用Western blot