心律失常后心肌組織中腦鈉肽的表達(dá)變化及法醫(yī)學(xué)意義.pdf

1、目的：
　　本研究分為兩部分，第一部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)氯化鈣(CaCl2)誘導(dǎo)大鼠心律失常，通過(guò)免疫組織化學(xué)(IHC)染色、Western Blot、Real-time PCR、ELISA探究大鼠心律失常后不同時(shí)間點(diǎn)心肌組織中BNP蛋白、mRNA的表達(dá)規(guī)律，以及血清中BNP濃度的變化規(guī)律;第二部分人體標(biāo)本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組織化學(xué)染色、HE染色、免疫膠體金法以及分子病理學(xué)方法來(lái)探究ARVC/D死者心肌組中的BNP以及心包液中BNP的表達(dá)情況

2、，以期為致死性心律失常的法醫(yī)病理學(xué)診斷提供依據(jù)。
　　方法：
　　一、心律失常動(dòng)物模型的建立
　　由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重300～350g。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，將其隨機(jī)分為2組（生理鹽水對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組），每個(gè)組再分成6個(gè)亞組(0min組、10min組、30min組、1h組、3h組、6h組)，每個(gè)亞組6只大鼠。實(shí)驗(yàn)組通過(guò)微量注射泵定時(shí)定量注射CaCl2來(lái)誘導(dǎo)

3、心律失常，建立大鼠心律失常模型，并用Powerlab監(jiān)測(cè)記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)大鼠心電改變情況，在時(shí)間節(jié)點(diǎn)時(shí)泵入兩倍劑量的CaCl2誘導(dǎo)惡性心律失常來(lái)處死動(dòng)物。生理鹽水對(duì)照組在相同時(shí)間注入與CaCl2等量的生理鹽水作為對(duì)照，并用Powerlab監(jiān)測(cè)記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)大鼠心電改變情況，在時(shí)間節(jié)點(diǎn)通過(guò)頸椎脫位處死動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不滿足實(shí)驗(yàn)條件的動(dòng)物均被剔除實(shí)驗(yàn)組。大鼠處死后，采集心血、分離血清用于ELISA檢測(cè)，取出大鼠心臟，將大鼠心臟橫斷為兩部分。上

4、半部分心肌放入4％多聚甲醛固定、制作蠟塊，分別用于HE染色、免疫組織化學(xué)染色;下半部分心肌組織提取蛋白及RNA，用于Western blot和Real-time PCR檢測(cè)。
　　二、人體標(biāo)本實(shí)驗(yàn)分組
　　心源性猝死案例的主要尸檢所見(jiàn)為:急性心肌梗死案例可見(jiàn)新鮮的局部心肌損傷（心肌纖維嗜伊紅染色增強(qiáng)，典型的缺血性凝固性壞死伴或不伴心肌間質(zhì)出血，或炎性細(xì)胞浸潤(rùn)）;心肌缺血組案例可見(jiàn)彌漫性間質(zhì)充血、水腫，片狀心肌嗜伊紅染色增強(qiáng)，

5、部分伴有多發(fā)出血和收縮帶樣改變，但無(wú)心肌壞死;致心律失常型右室心肌病案例遵循Protonotarios和Basso的診斷標(biāo)準(zhǔn)，可見(jiàn)嚴(yán)重右心室擴(kuò)張及右室游離壁心肌組織被纖維、脂肪替代，心肌萎縮，且沒(méi)有冠狀動(dòng)脈病變。
　　三、HE及IHC染色
　　取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的心臟及人體心肌（左心室側(cè)壁、室間隔、右心室側(cè)壁）經(jīng)4％多聚甲醛固定24h、脫水、透明、石蠟包埋，制作成5μm的切片后，再進(jìn)行脫蠟、水化，進(jìn)行HE及IHC染色。
　　四

6、、Western blot檢測(cè)大鼠心肌中BNP的表達(dá)
　　通過(guò)蛋白裂解液提取動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的生理鹽水組及心律失常組大鼠心肌總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，取30ug總蛋白樣品通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳，將分離出的蛋白轉(zhuǎn)印在PVDF膜上，經(jīng)過(guò)5％脫脂奶粉封閉2h、兔抗BNP一抗(1∶1000)4℃過(guò)夜孵育、山羊抗兔二抗孵育2h，最后用ECL發(fā)光液發(fā)光，檢測(cè)BNP條帶(13.6kD)及GAPDH條帶(34kD)平均光密度值，并以其二者比值作為B

7、NP的相對(duì)表達(dá)量。
　　五、ELISA法檢測(cè)大鼠血清中BNP的濃度
　　動(dòng)物處死后立刻開胸用注射器吸取心血，并3000r/min、離心15min，留取血清，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，根據(jù)紫外分光光度計(jì)讀取的各樣本及標(biāo)準(zhǔn)蛋白吸光度值計(jì)算各樣品的BNP濃度。
　　六、免疫膠體金法檢測(cè)人體心包液中NT-proBNP濃度
　　解剖時(shí)留取心包液用生理鹽水稀釋2倍，按試劑盒說(shuō)明書滴加稀釋后樣品，室溫靜置15min，

8、通過(guò)免疫定量分析儀讀取NT-proBNP的濃度。
　　七、Real-time PCR法檢測(cè)大鼠及人體心肌標(biāo)本中BNP mRNA的表達(dá)
　　使用RNAiso Plus試劑盒提取大鼠及人體心肌標(biāo)本中的總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定每個(gè)RNA樣品的OD值及濃度，當(dāng)OD260/280比值在1.8-2.0時(shí)認(rèn)為RNA濃度和純度合格，將樣品部分RNA稀釋成200ng/μl，并按PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑

9、盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將反轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的cDNA使用SYBR(@)Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒及ABI PRISM(@)7500 Real-time PCR System進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)ΔΔCT法以GAPDH為內(nèi)參來(lái)計(jì)算cDNA的相對(duì)量，來(lái)分析mRNA的表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　一、心電監(jiān)測(cè)
　　心電監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示生理鹽水對(duì)照組的大鼠心電未發(fā)生明顯改變，實(shí)驗(yàn)組大鼠在給予4mg/100g劑量的CaCl2時(shí)，心電檢測(cè)

10、結(jié)果可見(jiàn)不同類型的心律失常波形，大多數(shù)為竇性心動(dòng)過(guò)速、竇性停搏及各種類型的傳導(dǎo)阻滯，部分大鼠出現(xiàn)輕微的室性心律失常，當(dāng)給予2倍劑量CaCl2(8mg/100g)時(shí)，可見(jiàn)到室性心動(dòng)過(guò)速、室顫。
　　二、HE及IHC染色
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)各生理鹽水對(duì)照組大鼠心肌未見(jiàn)明顯病理組織學(xué)改變，心肌結(jié)構(gòu)清晰、排列整齊、橫紋可見(jiàn)、細(xì)胞核完整。
　　人體標(biāo)本ARVC/D組心肌HE染色可見(jiàn)右室游離壁心肌組織被纖維、脂肪替代，心肌萎縮，且冠狀動(dòng)

11、脈病變;AMI組案例可見(jiàn)局部心肌損傷，包括心肌纖維嗜伊紅染色增強(qiáng)，典型的缺血性凝固性壞死伴或不伴心肌間質(zhì)出血，或炎性細(xì)胞浸潤(rùn);IHD組案例可見(jiàn)彌漫性間質(zhì)充血、水腫，片狀心肌嗜伊紅染色增強(qiáng)，部分伴有多發(fā)出血和收縮帶樣改變，但無(wú)心肌壞死。
　　三、Western blot檢測(cè)大鼠心肌中BNP蛋白的表達(dá)
　　生理鹽水對(duì)照組中，各時(shí)間組BNP的表達(dá)基本沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;實(shí)驗(yàn)組中，0min組中BNP表達(dá)量沒(méi)有改變;10min時(shí)開始升高，

12、30min時(shí)達(dá)到第一個(gè)峰值;隨后開始下降，在3h組降到最低，在6h組再次升高，達(dá)到第二個(gè)峰值，實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間段與相應(yīng)對(duì)照組比較除0min組、3h組外均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　四、ELISA法檢測(cè)大鼠血清中BNP的濃度
　　在生理鹽水對(duì)照組中，各個(gè)時(shí)間組血清中BNP濃度沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)組中，血清BNP濃度在0min組、10min組幾乎沒(méi)有改變，而在30min后連續(xù)升高，直至6h達(dá)到峰值。實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間段與相應(yīng)對(duì)照組比較除0min組

13、外均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　五、免疫膠體金法檢測(cè)人體心包液中NT-proBNP的濃度
　　參照臨床上NT-proBNP的參考值，除對(duì)照組外其他各組心包液中NT-proBNP濃度均升高。與對(duì)照組相比較，ARVC/D組、IHD組及AMI組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而DAR組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　六、Real-time PCR檢測(cè)心肌中BNPmRNA的表達(dá)
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)生理鹽水對(duì)照組中，各時(shí)間組mRNA表達(dá)量沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)組，B

14、NP mRNA表達(dá)量在0min時(shí)沒(méi)有改變，10min時(shí)迅速上升、并達(dá)到第一個(gè)峰值;30min時(shí)開始下降，1h下降至最低;3h再一次爬升，第二個(gè)高峰出現(xiàn)在6h，實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間段與相應(yīng)對(duì)照組比較除0min組外均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　人體標(biāo)本實(shí)驗(yàn)ARVC/D組、IHD組及AMI組中左、右心室BNP mRNA的表達(dá)均高于對(duì)照組。DAR組中左、右心室BNP mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在左心室的表達(dá)低于IHD組和AMI組。

15、　　七、心包液中NT-proBNP及心肌中BNP mRNA與性別、年齡、心臟重量、雙肺重量的相關(guān)性分析
　　通過(guò)Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)心包液中NT-proBNP及心肌中BNP mRNA與性別、年齡、心臟重量、雙肺重量的相關(guān)性，在所有案例中，心包液中NT-proBNP濃度與性別、年齡、心臟重量、雙肺重量沒(méi)有相關(guān)性(p＞0.05)，但與左心室前壁心肌BNP mRNA、左心室后壁心肌BNP mRNA、右心室心肌BNP mRNA呈現(xiàn)輕

16、度正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為:r=0.418(p=0.001)、r=0.410(p=0.020)、r=0.383(p=0.004)。心臟重量與左心室前壁心肌BNP mRNA、左心室后壁心肌BNP mRNA、右心室心肌BNP mRNA呈現(xiàn)輕度正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為:r=0.426(p=0.001)、r=0.458(p=0.000)、r=0.310(p=0.02)。ARVC/D組中各參數(shù)間均無(wú)相關(guān)性。
　　結(jié)論：
　　1、CaCl2

17、誘導(dǎo)心律失常后，大鼠心肌組織及血清中BNP的表達(dá)增加。
　　2、心臟對(duì)短時(shí)間的心律失常會(huì)產(chǎn)生代償作用，而對(duì)長(zhǎng)時(shí)間心律失常失去了代償作用，心臟功能出現(xiàn)衰竭。
　　3、在短時(shí)間(＜10min)心律失常后，大鼠心肌組織中BNP mRNA的表達(dá)升高而其蛋白及血清中BNP并未升高。
　　4、在長(zhǎng)時(shí)間(＞1h)心律失常后，大鼠心肌組織中BNP mRNA、蛋白及血清中BNP均明顯升高。
　　5、致心律失常型右室心肌病患者的心肌