微流控芯片用于C反應(yīng)蛋白核酸適體的篩選研究.pdf

1、核酸適體(aptamers)是指可與目標(biāo)分子特異性結(jié)合的寡聚核苷酸親和配體-即單鏈脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。核酸適體具有許多優(yōu)良特性，在疾病檢測(cè)、藥物研發(fā)、臨床治療及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理研究等多個(gè)領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用前景。目前，限制核酸適體應(yīng)用的瓶頸仍是核酸適體的高效篩選。傳統(tǒng)SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，指數(shù)富集式配體系統(tǒng)進(jìn)化

2、)技術(shù)一般需要8～20輪甚至30輪的篩選，耗時(shí)、費(fèi)力。因此迫切需要發(fā)展新的快速高效的核酸適體的篩選方法。本工作致力于建立微流控SELEX篩選平臺(tái)，發(fā)展核酸適體的快速高效的篩選方法，以C反應(yīng)蛋白為例進(jìn)行核酸適體的篩選并考察其親和力、特異性，研究?jī)?nèi)容包括：
　　為了縮短整個(gè)篩選流程的時(shí)間，本工作借助微流控芯片的高分離效率，設(shè)計(jì)了一種操作簡(jiǎn)便，無(wú)需外加分離裝置的微流控芯片。芯片由四條直通道組成，每條通道中間有一收縮段，能夠截留一定尺寸的

3、微珠。由于芯片的制作需要較好的、穩(wěn)定的刻蝕條件及在此條件下的刻蝕速度，因此本文對(duì)刻蝕液成分、刻蝕溫度、刻蝕速度進(jìn)行了優(yōu)化和測(cè)量。在最優(yōu)的刻蝕條件下，通過(guò)控制刻蝕時(shí)間獲得不同深度的通道，經(jīng)兩次刻蝕，得到能夠截留住一定尺寸微珠的芯片。
　　以C反應(yīng)蛋白作為模型，建立了一種蛋白質(zhì)核酸適體篩選的微流控SELEX平臺(tái)。首先將包被了C反應(yīng)蛋白的聚苯乙烯微珠固定于芯片通道的收縮段處，再通入文庫(kù)，與C反應(yīng)蛋白有結(jié)合能力的序列就會(huì)因結(jié)合而保留在微珠

4、上而從整個(gè)文庫(kù)中分離出來(lái)，同時(shí)在每輪正篩前采用微孔板法進(jìn)行了反篩操作。以BSA為反篩靶分子共進(jìn)行了10輪的篩選，對(duì)其中的第六輪、第八輪、第十輪的富集文庫(kù)進(jìn)行TA克隆測(cè)序及親和力、特異性分析，獲得了一條與C反應(yīng)蛋白較好親和力的核酸適體，其解離常數(shù)為3.6 nM。
　　考慮到C反應(yīng)蛋白的檢測(cè)常在血液中進(jìn)行，而血液中HSA和IgG的含量較高，因此本文從第五輪開(kāi)始以HSA、IgG和BSA為反篩靶分子進(jìn)行了另外的四輪篩選。對(duì)以HSA、IgG